來源：《華西口腔醫(yī)學雜志》2016年4月第34卷第2期
作者：高敬 黃文明（通訊作者）
作者單位：重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科·口腔疾病與生物醫(yī)學重慶市重點實驗室·重慶市高校市級口腔生物醫(yī)學工程重點實驗室，重慶 401147
[摘要] 目的 研究變異鏈球菌耐酸毒力因子質子移位膜ATP酶（F-ATPase）在不同pH環(huán)境和齲病發(fā)生發(fā)展過程中的表達，評價F-ATPase在齲病進展中的動態(tài)變化。方法將變異鏈球菌菌懸液在不同pH（pH4.0~7.0）和不同葡萄糖濃度（含5%和不含葡萄糖）的BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，檢測F-ATPase基因的表達水平。將雄性Wistar大鼠隨機分成致齲組和對照組，其中致齲組喂養(yǎng)致齲飼料及5%葡萄糖水，對照組喂養(yǎng)普通飼料。每2周采集菌斑樣本，檢測F-ATPase基因的表達水平。第11周時取大鼠上下頜骨標本，對磨牙進行齲損評定。結果 1）5%葡萄糖濃度下變異鏈球菌F-ATPase基因的表達高于不含葡萄糖（P<0.05），在pH5.0時F-ATPase基因的表達最高，pH4.0時表達最低（P<0.05）。2）成功構建了齲病動物模型，在齲病發(fā)生發(fā)展過程中，致齲組和對照組F-ATPase的表達逐漸增強，致齲組表達高于對照組（P<0.05）。結論 耐酸毒力因子F-ATPase的表達變化與齲病的發(fā)生發(fā)展密切相關。
[關鍵詞]齲?。谎谰?；質子移位膜ATP酶；pH
耐酸性是細菌在致齲過程中最重要的毒力表現(xiàn)，細菌產酸后若不能耐酸， 則細菌就不能繼續(xù)生存、代謝。Bender等[1]研究發(fā)現(xiàn)細菌的耐酸性與細菌膜對質子的透過性有關，變異鏈球菌的耐酸性主要依賴于細胞膜上的質子移位膜ATP酶（membranebound proton-translocatingATPase，F(xiàn)-ATPase），通過F-ATPase將質子泵出胞內，使胞內pH（pHi）高于胞外pH（pHo），即維持了一個跨膜梯度ΔpH（pHi-pHo），保持胞內pH接近中性，保護胞漿中與糖酵解相關酶的活性，使菌細胞在低pH的苛刻環(huán)境中仍能產酸、生存并最終導致齲病的發(fā)生[2-3]?？梢?，F(xiàn)-ATPase是變異鏈球菌致齲菌耐酸的引擎和馬達，與齲病的發(fā)生密切相關。
目前尚缺乏關于變異鏈球菌耐酸毒力因子FATPase在齲病發(fā)生發(fā)展過程中的研究，為了進一步了解F-ATPase在齲病進展中的變化，本研究建立致齲動物模型縱向研究F-ATPase基因在齲病進展中的表達變化，比較F-ATPase基因在不同pH環(huán)境的表達，以評價生物膜中耐酸毒力因子F-ATPase與齲病發(fā)生的關系。
1 材料和方法
1.1 實驗菌株及動物
變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）標準株UA159由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供。18 d齡的雄性Wistar大鼠購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證編號為SYXK（渝）2012-0001。
1.2 主要試劑及儀器
BHI培養(yǎng)基（OXOID公司，英國），YJ-875型超凈工作臺（蘇州市華宇凈化設備有限公司），F(xiàn)Q-聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（Bio-Rad公司，美國） ，200型分光光度計（Thermo Fisher公司，美國），pH計（Mettler Toledo公司，瑞士），Bio-Rad電泳儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.3 引物設計
根據(jù)GenBank報道的變異鏈球菌F-ATPase β亞基基因[4]序列及16sRNA基因序列（GenBankaccession number NC_004350），采用Primer primer 5.0計算機軟件設計引物。F-ATPase上游引物 5’-CGGATGCGTGTTGCTCTTACTG-3’，下游引物5’-GGCTGATAACCAACGGCTGATG-3’；16sRNA上游引物5’-TGGAACTGAGACACGGTCCA-3’，下游引物5’-CGCTTTACGCCCAGTAATTCCG-3’。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
1.4 不同pH和葡萄糖濃度下變異鏈球菌F-ATPase基因的表達
將變異鏈球菌標準株UA159復蘇，培養(yǎng)24 h，3 000 r·min-1離心15 min， 棄上清，用無菌生理鹽水于紫外分光光度計540 nm處制備成吸光度為1.0的菌懸液備用。以0.5為間隔配制pH4.0~7.0系列的含5%葡萄糖和不含葡萄糖的BHI液體培養(yǎng)基。取變異鏈球菌懸液，按菌液與BHI液體培養(yǎng)基1∶10的體積比接種細菌 ，37 ℃厭氧培養(yǎng)至16 h指數(shù)生長期，每個樣品一式3份，3 000 r·min-1離心 15 min收集菌體，通過RNAiso Plus（Takara公司，日本）提取RNA，逆轉錄成 cDNA，PCR擴增反應總體積為20 μL，含SYBR Premix Ex Taq（2x）10 μL （包括DNA Taq酶、Mg2+、dNTP、SYBR GreenⅠ熒光染料和Buffer緩沖液）、上下游引物各0.5 μL、模板cDNA 2 μL，加滅菌去離子水至20 μL。反應循環(huán)參數(shù)設置為三步法PCR擴增標準程序：95 ℃預變性3min，95 ℃變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。在延伸階段收集熒光信號，循環(huán)結束后附加溶解曲線分析：95 ℃ 15 s，62 ℃ 23 s，95 ℃ 15 s。實驗重復3次， 取均值，收集實驗數(shù)據(jù)，測定各樣品的循環(huán)閾值（Ct值），通過2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。
1.5 齲病動物模型的建立及變異鏈球菌F-ATPase基因表達檢測
12只18 d齡的雄性Wistar大鼠，隨機分為2組，致齲組6只，喂養(yǎng)致齲飼料2 000號及5%葡萄糖水；對照組6只，喂養(yǎng)普通飼料。從第1周開始每2周采集菌斑樣本（共6次），采集樣本前2 h大鼠禁食，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，以棉拭子采集磨牙面及頰舌（頰腭）面的菌斑，置于含硫乙醇酸鹽傳送液的離心管中洗脫，將樣本收集于離心管中，提取混合菌斑RNA，進行逆轉錄和實時熒光定量PCR（引物及反應體系同上）。結果取均值，通過2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。
第11周時處死大鼠，取上下頜骨標本，染色，根據(jù)Keyes經(jīng)典評分方法[5] 對磨牙進行齲損評定，將齲損分為4級。E級：僅限于釉質；Ds級：累及釉質及牙本質外層1/4以內；Dm級：累及牙本質厚度的1/4至3/4；Dx級：累及超過牙本質厚度的3/4，甚至達牙本質全層。
1.6 數(shù)據(jù)分析
采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，多組之間比較采用單因素方差分析。
2 結果
2.1 變異鏈球菌F-ATPase基因及16sRNA內參基因
F-ATPase基因和16sRNA內參基因經(jīng)常規(guī)PCR都能得到特異性擴增，2%凝膠電泳顯示各基因各實驗組中的cDNA產物均為單一條帶（圖1、2），條帶片段大小與引物預期擴增片段大小一致。
2.2 不同pH和葡萄糖濃度下變異鏈球菌F-ATPase基因的表達
不同pH和葡萄糖濃度下變異鏈球菌F-ATPase基因的表達見圖3。實驗結果顯示，1）在pH5.0時FATPase基因的表達最高，然后依次是pH5.5、6.0、6.5， 7.0，4.5，最低的是pH4.0（P<0.05）；2）5%葡萄糖濃度下F-ATPase的表達高于不含葡萄糖（P<0.05）。
2.3 大鼠磨牙齲病動物模型的建立
11周后處死大鼠，取磨牙進行Keyes評分，結果見圖4和表1。實驗成功構建了齲病動物模型，各組Wistar大鼠磨牙均有不同程度的齲損發(fā)生，但是齲損發(fā)生的嚴重程度、累及范圍不盡相同。致齲組齲齒計分明顯高于對照組，且齲壞病變的程度要高于對照組。對照組牙齒的損壞最小，僅達到牙本質中層，致齲組齲損多數(shù)達牙本質中層，其次是牙本質深層。
2.4 齲病過程中F-ATPase基因的表達
齲病過程中各組F-ATPase基因的表達見表2。在齲病的發(fā)生發(fā)展過程中，隨時間的推移各組F-ATPase基因的表達逐漸增強，致齲組表達高于對照組（P<0.05），第9周后，致齲組增長程度有一定下降，對照組的表達下降。
3 討論
F-ATPase具有調節(jié)胞漿pH以及決定菌細胞耐酸性的生物學特性。細菌細胞的胞外質子向胞內擴散降低胞內pH，影響對酸敏感的糖酵解的活性，為了最大程度的發(fā)揮糖酵解的活性，致齲菌通過細胞膜和F-ATPase抵抗胞漿的酸化，F(xiàn)-ATPase將質子泵出細胞從而調節(jié)pH，使致齲菌在低pH值環(huán)境下仍能進行糖酵解 [6-7]。
早期齲病研究表明，環(huán)境pH和糖在齲病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用 ，而口腔原位環(huán)境是一個復雜且動態(tài)變化的環(huán)境，獲取大鼠致齲過程中牙菌斑pH較困難，為了研究高糖濃度下變異鏈球菌FATPase基因的表達與pH之間的關系 ，本研究設計了體外實驗，結果顯示，變異鏈球菌在5%葡萄糖濃度下耐酸毒力因子F-ATPase表達高于不含葡萄糖環(huán)境。研究[8]表明，在高糖濃度下，變異鏈球菌的黏附毒力、產酸毒力、耐酸毒力及耐藥毒力均高于低糖或無糖環(huán)境下， 由此推測，高糖濃度下變異鏈球菌致齲能力上調。當外界環(huán)境中有充足的糖源時，變異鏈球菌能迅速合成胞外多糖，伴隨著產酸耐酸能力的增強，環(huán)境中pH迅速下降，變異鏈球菌在酸壓力狀態(tài)下通過上調耐酸因子F-ATPase表達來維持生存代謝。Kuhnert等[4]對浮游狀態(tài)的變異鏈球菌F-ATPase基因表達研究證實 ，在pH5.0時mRNA的表達水平大約是pH7.0時的2倍。研究[9]發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)基中的pH由8.0下降至5.0時，變異鏈球菌的F-ATPase活性提高4倍，從而增強了其質子泵作用。本實驗研究也證實，高糖濃度下變異鏈球菌F-ATPase基因的表達高于無糖或低糖環(huán)境，F(xiàn)-ATPase的表達在pH5.0時最高，pH4.0時最低，pH5.0到7.0時F-ATPase表達緩慢降低，在pH5.0以下時F-ATPase的表達急劇減少。學者[10]研究對比了干酪乳桿菌、變異鏈球菌和血鏈球菌3種耐酸性分別為高、中、低的口腔耐酸菌膜結合F-ATPase的pH活性范圍，發(fā)現(xiàn)其最適pH值分別為5.5、6.0和7.0，證明了細菌的相對耐酸性與F-ATPase的活性和最適pH值有關，活性越大，最適pH值越低。在酸性環(huán)境中排除胞內多余H+能力越強，因而越耐酸?？梢娫谧钸mpH以內，F(xiàn)-ATPase的表達隨pH降低而升高，而當pH降低至5.0以下時，酶活性超過最適pH使F-ATPase的表達量下降，同時強酸的環(huán)境壓力可以使細菌合成ATP不足，并破壞細胞質內的蛋白結構使之死亡[11]。通過對大腸桿菌的研究，Kasimoglu等[12]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-ATPase的表達量在轉錄和翻譯水平的調控是多層次的，其中細菌的生長率在F-ATPase的產生和表達中起著比較重要的作用，大量細菌死亡也會導致生物膜中F-ATPase的表達量大大減少。同樣在pH5.0以下的環(huán)境，隨著變異鏈球菌的大量死亡，F(xiàn)-ATPase的基因表達在高糖和無糖環(huán)境中差異較小。
齲齒Keyes評分結果顯示，致齲組齲齒計分明顯高于對照組，且齲壞病變的程度要高于對照組，證明本實驗齲齒模型的建立成功。實驗中所使用的致齲飼料為高糖飼料，大鼠牙菌斑長期暴露在高糖的環(huán)境中，致齲菌有足夠的底物產酸，造成牙菌斑內pH持續(xù)下降，在齲病發(fā)生發(fā)展過程中，致齲組和對照組F-ATPase表達均逐漸增強，致齲組表達高于對照組，第9周后，致齲組增長程度有一定下降，對照組的表達有一定下降。在實驗過程中第5周時大鼠齲壞開始出現(xiàn)， 在齲壞啟動前期，變異鏈球菌等致齲菌大量產酸，使菌斑內pH達到脫礦臨界值pH5.0~5.5。F-ATPase是一種應激蛋白，當外界環(huán)境pH下降時，變異鏈球菌F-ATPase基因表達上調，從而合成更多的F-ATPase蛋白以排除更多的氫離子維持細菌的生存，當更多的氫離子排到外環(huán)境時，環(huán)境中的pH繼續(xù)下降酸蝕牙齒致齲。當齲病發(fā)展到第9周時，牙菌斑內微生物已經(jīng)形成一個穩(wěn)定的動態(tài)平衡狀態(tài)，隨著唾液蛋白等的中和緩沖作用，牙菌斑內pH值上升[13]，F(xiàn)-ATPase表達下調。學者[14]分離臨床牙菌斑中變異鏈球菌，結果表明高齲牙菌斑變異鏈球菌分離株黏附、產酸和耐酸能力高于無齲牙菌斑分離株。本實驗中致齲組耐酸因子表達亦高于對照組。對照組大鼠使用的普通飼料內碳水化合物含量較低，大鼠本身的口腔自潔能力較強，唾液分泌較多，對菌斑內pH緩沖能力強，使菌斑pH維持在一個穩(wěn)定的范圍，F(xiàn)-ATPase的表達也維持在一個穩(wěn)定的范圍。
本文對變異鏈球菌耐酸毒力因子F-ATPase在不同pH中的基因表達進行了研究，并建立了大鼠致齲模型，結果顯示，變異鏈球菌F-ATPase在pH5.0時表達最高，致齲組大鼠在齲病發(fā)展過程中F-ATPase表達上調，提示耐酸毒力因子F-ATPase在釉質脫礦及齲病的形成中發(fā)揮著重要的作用。
