[摘要]
目的
探討CCL5/CCR5生物軸在涎腺腺樣囊性癌（SACC）細(xì)胞嗜神經(jīng)侵襲中的作用。方法 應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SACC-LM細(xì)胞中趨化因子受體CCR5的表達(dá)；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)周?chē)窠?jīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中趨化因子CCL5的表達(dá)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CCL5對(duì)SACC-LM細(xì)胞內(nèi)F肌動(dòng)蛋白的作用，并通過(guò)劃痕和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察趨化因子CCL5和其受體CCR5對(duì)SACC-LM細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力的作用。結(jié)果 SACC-LM細(xì)胞高表達(dá)趨化因子受體CCR5；周?chē)窠?jīng)原代培養(yǎng)上清液中趨化因子CCL5質(zhì)量濃度為（359.2±15.8）、（696.4±22.6） pg·mL-1；趨化因子CCL5和其受體CCR5結(jié)合后對(duì)SACC-LM細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力可以產(chǎn)生促進(jìn)作用。結(jié)論 CCL5/CCR5生物軸可能在SACC細(xì)胞嗜神經(jīng)侵襲中起著重要的作用。
[關(guān)鍵詞]
唾液腺； 涎腺腺樣囊性癌； CCL5； CCR5； 嗜神經(jīng)侵襲
涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是一種較少見(jiàn)的惡性腫瘤，對(duì)周?chē)窠?jīng)侵襲的傾向性被視為SACC的特征性生物學(xué)行為之一[1]。在臨床上，周?chē)窠?jīng)侵襲（peripheral nerve invasion，PNI）與SACC的擴(kuò)散、復(fù)發(fā)和預(yù)后密切相關(guān)[2-3]。在對(duì)SACC周?chē)窠?jīng)侵襲性的研究中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多相關(guān)蛋白分子，但仍不能完全解釋SACC嗜神經(jīng)侵襲的機(jī)制，隨著“腫瘤微環(huán)境”學(xué)說(shuō)的出現(xiàn)，學(xué)者們逐漸將其機(jī)制的研究回歸系統(tǒng)化，而不再考慮單一蛋白分子的作用。因此，為了更好地詮釋PNI的作用機(jī)制，需要有更多的相關(guān)蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)和研究，以完善PNI的“侵襲相關(guān)系統(tǒng)”。
Virchow于1863年首先報(bào)告慢性炎癥與腫瘤之間存在密切的關(guān)系[4]。近幾年隨著炎癥因子與腫瘤之間關(guān)系研究的不斷深入，趨化因子與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究越來(lái)越受到人們的重視。申志遠(yuǎn)等[5]通過(guò)對(duì)臨床病理標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)：趨化因子受體CCR5在人SACC組織中高表達(dá)，且與SACC的嗜神經(jīng)侵襲性密切相關(guān)。本研究旨在以前期病理標(biāo)本研究為基礎(chǔ)，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察趨化因子CCL5/CCR5生物軸對(duì)SACC細(xì)胞系SACC-LM的趨化性和侵襲性的作用，為CCL5/CCR5生物軸在SACC的PNI中的作用研究提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。
1，材料和方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
兔抗人多克隆抗體和CCL5酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒、FITC標(biāo)記的熒光二抗（PeproTech公司，美國(guó)）；Transwell小室（Corning公司，美國(guó)）；Matrigel膠（BD公司，美國(guó)）；人重組活性蛋白CCL5（上海普欣公司）；羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽抗體（Sigma公司，美國(guó)）。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
將人SACC細(xì)胞系SACC-LM（圖1）置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，37 ℃，5%CO2孵育箱條件下培養(yǎng)。術(shù)中頸淋巴組織清掃所得人周?chē)窠?jīng)在無(wú)菌條件下采用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，僅收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液。
1.2.2 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)趨化因子受體CCR5在SACC-LM細(xì)胞中的表達(dá)
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SACC-LM細(xì)胞接種至12 mm×12 mm的小方片上，孵育箱內(nèi)孵育24 h，采用PBS清洗3次，4%的多聚甲醛進(jìn)行固定15 min，PBS再次清洗3次，0.5%Triton X-100覆蓋細(xì)胞，37 ℃孵育10 min，PBS洗滌3次后孵育一抗，即采用1%的BSA將一抗稀釋至所需濃度（1︰100稀釋），滴加至小方片上將細(xì)胞覆蓋。置于4 ℃冰箱內(nèi)過(guò)夜后次日37 ℃條件下復(fù)溫30 min，PBS洗滌3次，然后孵育熒光二抗工作液，將熒光二抗工作液滴加至細(xì)胞表面，37 ℃避光孵育2 h，PBS清洗3次，DAPI染色并置于37 ℃
避光環(huán)境下再次孵育15 min，最后避光條件下，PBS清洗3次后，將小方片置于熒光顯微鏡下觀察，以PBS代替一抗稀釋液組作為空白對(duì)照組。
1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)趨化因子受體CCR5在SACC-LM細(xì)胞中的表達(dá)
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，棄培養(yǎng)液后用PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中和胰蛋白酶，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液后再加入含3%胎牛血清的PBS離心清洗1次，將細(xì)胞重懸后轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，1 000 r·min-1離心5 min沉淀細(xì)胞后，加入100 μL一抗稀釋液（1︰100），置于37 ℃恒溫孵育箱中孵育30 min，PBS離心清洗2次，加入FITC標(biāo)記的熒光二抗稀釋液，37 ℃孵育箱中避光孵育30 min，PBS離心清洗2次，4%多聚甲醛固定樣本。以未加一抗稀釋液組作為空白對(duì)照組。
1.2.4 ELISA法測(cè)定人周?chē)窠?jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)上清液中趨化因子CCL5的含量
手術(shù)切取的周?chē)窠?jīng)標(biāo)本無(wú)菌操作下立即放于含有1 000 U·L-1雙抗液的培養(yǎng)基內(nèi)，常溫下放置5 min。顯微鏡下去凈神經(jīng)組織周?chē)难獕K及黏膜，用組織剪剪成約1 mm×1 mm×1 mm的小塊，貼于25 mL塑料培養(yǎng)瓶壁上，加入適量的含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃恒溫貼壁2 h后翻瓶并加入適量的培養(yǎng)液。細(xì)胞爬出后，PBS液清洗3次，加入無(wú)血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h，將培養(yǎng)液棄掉更換無(wú)血清培養(yǎng)液后培養(yǎng)12 h和24 h，并分別收集上清液。采用CCL5檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣品中的CCL5表達(dá)量。以新鮮的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。每個(gè)樣品ELISA法至少檢測(cè)3個(gè)孔，均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)。
1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SACC-LM細(xì)胞經(jīng)CCL5處理前后細(xì)胞內(nèi)F肌動(dòng)蛋白量的變化
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，棄培養(yǎng)液后用PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中和胰蛋白酶，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液后再加入含3%胎牛血清的PBS離心清洗1次，將細(xì)胞重懸后轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，1 000 r·min-1離心5 min沉淀細(xì)胞后，加入濃度為100 ng·mL-1的CCL5無(wú)血清RPMI1640（200 μL），37 ℃孵育30 min后，離心洗滌2次，滴加羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽抗體（1︰100稀釋）并重懸，37 ℃避光孵育30 min，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度平均值。以加入無(wú)血清RPMI1640（200 μL）作為空白對(duì)照組。
1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察CCL5對(duì)SACC-LM細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響
將細(xì)胞以每孔2×105個(gè)的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)到單層完全融合時(shí)，用10 μL Tip槍頭在單層細(xì)胞上劃痕，建立細(xì)胞劃痕模型，并用PBS清洗2次。加入含CCL5（20 ng·mL-1）的無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基，37 ℃孵育箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，用倒置顯微鏡于0、48 h觀察劃痕愈合程度。以單純加入無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。
1.2.7 侵襲實(shí)驗(yàn)觀察CCL5對(duì)SACC-LM細(xì)胞侵襲能力的影響
Transwell小室內(nèi)為孔徑8 μm的多聚碳酸酯膜，用Matrigel膠（1︰5稀釋）包被后放置于專用的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SACC-LM細(xì)胞，血清饑餓12 h后，將細(xì)胞放于上室內(nèi)，在下室中，加入600 μL含不同濃度趨化因子CCL5的無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液（0、10、20、50、100、300、500 ng·mL-1），并將培養(yǎng)板置于孵育箱內(nèi)孵育12 h。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以在下孔中加入不含CCL5的無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組。取出嵌套小室，將上室多聚碳酸酯膜內(nèi)面的細(xì)胞用棉簽擦凈，將膜底面的細(xì)胞用多聚甲醛固定，并用蘇木素和伊紅進(jìn)行細(xì)胞染色，顯微鏡下讀取多聚碳酸酯膜底面穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)目。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：于放大200倍光學(xué)顯微鏡下選取5個(gè)視野，記錄穿過(guò)多聚碳酸酯膜的細(xì)胞總數(shù)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05說(shuō)明研究結(jié)果的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 ，結(jié)果
2.1 細(xì)胞免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)趨化因子受體CCR5在SACC-LM細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果
細(xì)胞免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)均發(fā)現(xiàn)SACC-LM細(xì)胞可以表達(dá)趨化因子受體CCR5（圖2）。
由圖2可見(jiàn)，在細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，熒光顯微鏡下觀察趨化因子受體CCR5表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，呈現(xiàn)出綠色熒光；利用CCR5抗體+流式細(xì)胞術(shù)同樣發(fā)現(xiàn)SACC-LM細(xì)胞有趨化因子受體CCR5的表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率為81.9%。
2.2 ELISA測(cè)定結(jié)果
ELISA法測(cè)定人周?chē)窠?jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)上清液中趨化因子CCL5的表達(dá)量為（359.2±15.8）、（696.4±22.6） pg·mL-1，均比空白對(duì)照組多（P<0.05）（圖3）。
2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)F肌動(dòng)蛋白量的變化
加入趨化因子CCL5孵育30 min后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)SACC-LM細(xì)胞內(nèi)F肌動(dòng)蛋白的熒光表達(dá)強(qiáng)度，進(jìn)而反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)F肌動(dòng)蛋白量的多少。實(shí)驗(yàn)組中F肌動(dòng)蛋白的熒光表達(dá)強(qiáng)度為82.8%，明顯高于空白對(duì)照組（圖4）。
2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果
相同時(shí)間段內(nèi)實(shí)驗(yàn)組SACC-LM細(xì)胞劃痕模型的愈合速度明顯高于空白對(duì)照組（圖5）；侵襲實(shí)驗(yàn)中，加入趨化因子CCL5后各實(shí)驗(yàn)組穿越PC膜的細(xì)胞數(shù)目均有明顯上升，當(dāng)趨化因子CCL5的濃度為20 ng·mL-1時(shí)，穿越PC膜的細(xì)胞數(shù)最多（圖6）。
3，討論
惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)連續(xù)的、復(fù)雜的、系統(tǒng)性的過(guò)程，具有高度的特異性，雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)證明惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素參與的過(guò)程，但不同組織學(xué)類型的惡性腫瘤進(jìn)行特定的侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不清楚。趨化
因子可以調(diào)控細(xì)胞的遷移，其與相應(yīng)受體的結(jié)合可以引起細(xì)胞骨架蛋白的改變，使得細(xì)胞形成更多的偽足，進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，這是惡性腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的前提條件[6-7]。隨著趨化因子研究的不斷深入，其在惡性腫瘤中的作用已經(jīng)被多數(shù)
學(xué)者作為“腫瘤微環(huán)境學(xué)說(shuō)”的重要機(jī)制之一。趨化因子CCL5，屬于CC趨化因子家族的成員，具有介導(dǎo)免疫細(xì)胞定向趨化的作用[8-9]，其受體有3個(gè)，分別是CCR1、CCR3和CCR5，其中以CCL5與CCR5的親和力最強(qiáng)，構(gòu)成了CCL5/CCR5生物軸。國(guó)內(nèi)外許多
學(xué)者[10-11]認(rèn)為趨化因子CCL5和其受體CCR5在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色。有研究[11-12]表明，趨化因子CCL5與前列腺癌、胰腺癌及乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究[13-15]發(fā)現(xiàn)CCL5/CCR5生物軸可引起乳腺癌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架蛋
白的重排，使細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性增加，促進(jìn)了癌細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。在筆者前期的實(shí)驗(yàn)[16]中，發(fā)現(xiàn)CCL5/CCR5生物軸存在于人唾液腺SACC和周?chē)窠?jīng)之間的“微環(huán)境”中，并且通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明趨化因子CCL5可以明顯地促進(jìn)SACC細(xì)胞的趨化和侵襲能
力，這說(shuō)明CCL5/CCR5生物軸可能在SACC易侵襲周?chē)窠?jīng)中起著重要作用。但是，CCL5/CCR5生物軸在SACC細(xì)胞嗜神經(jīng)侵襲中的具體分子作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。
綜上所述，本研究通過(guò)細(xì)胞免疫熒光技術(shù)證實(shí)了趨化因子受體CCR5在SACC-LM細(xì)胞中的存在，利用ELISA法檢測(cè)到了周?chē)窠?jīng)細(xì)胞可以外分泌趨化因子CCL5。為了觀察趨化因子CCL5對(duì)SACC-LM細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響，筆者通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到趨化因子
CCL5促進(jìn)了SACC-LM細(xì)胞內(nèi)F肌動(dòng)蛋白的增多，這是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)的標(biāo)志之一；而后又在劃痕、侵襲實(shí)驗(yàn)中，從宏觀角度觀察到了CCL5/CCR5生物軸對(duì)SACC-LM細(xì)胞遷移及侵襲能力的促進(jìn)作用。以上結(jié)果說(shuō)明CCL5/CCR5生物軸在SACC細(xì)胞嗜神經(jīng)侵襲中可
能扮有重要的角色，有利于進(jìn)一步研究唾液腺SACC嗜神經(jīng)侵襲的機(jī)制。
來(lái)源：原創(chuàng) 李添翼 申志遠(yuǎn) 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志
