生物鐘基因?qū)歉慕ǖ挠绊?/span> 鄧旭亮 專家介紹：鄧旭亮，男，1972年2月生，北京大學(xué)口腔醫(yī)院科研副院長(zhǎng)，特診科主任、教授、主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，中國(guó)生物醫(yī)用材料產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟副理事長(zhǎng)，生物醫(yī)用材料北京實(shí)驗(yàn)室副主任，中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)生物材料分會(huì)理事。2016年入選科技部中組部“萬人計(jì)劃”，獲第七屆“全國(guó)優(yōu)秀科技工作者”，獲第十一屆光華工程科技獎(jiǎng)青年獎(jiǎng)，2015年獲長(zhǎng)江學(xué)者特聘教授，2014年度獲國(guó)家杰出青年科學(xué)基金資助，2013年獲選科技部中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才，2013年作為第一完成人獲教育部 “高等學(xué)?？茖W(xué)研究?jī)?yōu)秀成果獎(jiǎng)”技術(shù)發(fā)明二等獎(jiǎng)，2009年入選教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才”計(jì)劃。近年來作為項(xiàng)目負(fù)責(zé)人主持了21項(xiàng)科研項(xiàng)目，其中國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目6項(xiàng)、國(guó)家863項(xiàng)目4項(xiàng)、科技部國(guó)際合作項(xiàng)目、教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持項(xiàng)目、衛(wèi)生部行業(yè)科研專項(xiàng)課題、北京市科技計(jì)劃等，并作為主要完成人和學(xué)術(shù)骨干參加了國(guó)家及省部級(jí)科研項(xiàng)目14項(xiàng)。從口腔關(guān)鍵材料的臨床應(yīng)用特點(diǎn)及存在的問題出發(fā)，在新型口腔樹脂基修復(fù)材料及引導(dǎo)組織再生支架材料的組成、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、制備和功能仿生、納米效應(yīng)發(fā)揮及組織修復(fù)機(jī)理等方面進(jìn)行了長(zhǎng)期基礎(chǔ)研究，獲得了多項(xiàng)重要的理論研究進(jìn)展和應(yīng)用參加成果。發(fā)表論文177篇，其中SCI收錄論文65篇，其中通信作者40篇（近五年44篇，其中通訊作者27篇），總被引用743次（SCI他引677次），單篇引用最高111次，申請(qǐng)25項(xiàng)國(guó)家發(fā)明專利（其中第一發(fā)明人申請(qǐng)7項(xiàng)），授權(quán)13項(xiàng)，獲國(guó)藥局Ⅲ類醫(yī)療器械注冊(cè)證3個(gè)，國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)特邀報(bào)告11次，其中含大會(huì)報(bào)告5次（國(guó)際2次，國(guó)內(nèi)3次），已經(jīng)指導(dǎo)碩士研究生25名，博士生7名。 摘要 生物體的生理、生化和行為的周期性震蕩稱為生物節(jié)律，由生物鐘基因調(diào)控。數(shù)十種核心鐘基因中，Clock和Bmal1最早被發(fā)現(xiàn)，并且作為整個(gè)時(shí)鐘體系的起始因子。而骨再生和改建是解決當(dāng)今口腔醫(yī)學(xué)重要的前沿科學(xué)問題。因此本文以鐘基因和骨改建兩者關(guān)系為題，了解生物鐘基因的基本機(jī)制，以及生物鐘基因可能對(duì)骨改建造成的影響，初步探討Clock和Bmal1基因?qū)υ偕凸歉慕ǖ恼{(diào)控機(jī)制，總結(jié)近年來生物鐘基因影響骨改建的研究進(jìn)展。 1 生物鐘基因的特點(diǎn) 晝夜節(jié)律是持續(xù)運(yùn)行并且以大約24 h為周期的生物節(jié)律，是生物體的生理、生化和行為的周期性震蕩，是所有生物體對(duì)可預(yù)測(cè)的環(huán)境改變的一種綜合性適應(yīng)，這幾乎是所有真核生物和部分原核生物的基本特征［1］。從單細(xì)胞生物到人，從體溫的波動(dòng)、激素水平的漲落、識(shí)別和記憶能力的變化等都呈晝夜節(jié)律性。而在日常生活中，最明顯的晝夜節(jié)律是睡眠-覺醒這一生理變化。有兩種機(jī)制精確地控制著睡眠和覺醒的時(shí)間：一是機(jī)體狀態(tài)平衡機(jī)制，即睡眠穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)；另一個(gè)是晝夜節(jié)律，即在24 h內(nèi)，人體的生理機(jī)制會(huì)出現(xiàn)盛衰變化，從而調(diào)節(jié)睡眠時(shí)相［2］。這兩種機(jī)制的相互協(xié)調(diào)，影響著睡眠的時(shí)間點(diǎn)、長(zhǎng)度、質(zhì)量以及醒后人體的各種機(jī)能狀況，使得身體在需要時(shí)睡覺，在得到滿足后醒來［3］。 晝夜節(jié)律發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是分子計(jì)時(shí)器，即晝夜節(jié)律生物鐘，從哺乳動(dòng)物到細(xì)菌的大多數(shù)生物體都有這樣一個(gè)計(jì)時(shí)裝置［4］。早在2002年，有研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中，下丘腦的視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）是實(shí)現(xiàn)這一神經(jīng)系統(tǒng)功能的重要核團(tuán)，因而被稱為中樞生物鐘［5］。中樞生物鐘可以通過眼睛的特殊光感受器來感受外界環(huán)境明暗變化，再通過視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（非視細(xì)胞或視色素）將信息通過視網(wǎng)膜下丘腦束傳遞至SCN腹外側(cè)部即“視網(wǎng)膜-下丘腦信號(hào)通路”，從而導(dǎo)引位于SCN的主生物鐘的節(jié)律性振蕩，使輸出節(jié)律與太陽晝夜的變化一致。它使各種生命活動(dòng)（如體溫、血壓、激素分泌量、骨發(fā)育等）每天有節(jié)律并且有序的表現(xiàn)出來。 隨著研究進(jìn)展，截至2011年，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10余個(gè)核心生物鐘基因，比如Clock、Bmal1、Pers、Cry、Tim、Tau等，這些核心生物鐘基因在細(xì)胞內(nèi)互相作用，形成一系列的轉(zhuǎn)錄/翻譯的反饋環(huán)來調(diào)控彼此的表達(dá)量，從而使這些基因在恒定的光照-黑暗周期中呈現(xiàn)節(jié)律性的表達(dá)［6-7］?；騿?dòng)子內(nèi)的E-box序列（常規(guī)形式：CACGTG，非常規(guī)形式CACGTT等）是這些基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控的目標(biāo)［8］。核心鐘基因按其對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用分為兩大類：Clock和Bmal1被歸為正向調(diào)控部分；Cry1、Cry2、Per1和Per2被歸為負(fù)向調(diào)控部分［9］。 2006年，研究發(fā)現(xiàn)生物鐘基因的分子運(yùn)行機(jī)制大致是：Bmal1與Clock蛋白互為分子伴侶，二者相互結(jié)合成Bmal1/Clock異二聚體。Bmal1和Clock基因形成中心振蕩環(huán)的正向元件。Bmal1基因作為時(shí)鐘體系的起始因子，以Bmal1/Clock異二聚體的形式與靶基因啟動(dòng)子的E-box元件結(jié)合，最常見的是與含有CACGTG核苷酸序列的E-Box之間有著高度親和力（也有CACGTT的非常規(guī)的表現(xiàn)形式），然后驅(qū)動(dòng)3個(gè)周期基因（Per1、Per2和Per3）、2個(gè)隱花色素（Cry1和Cry2）和轉(zhuǎn)錄阻抑物REV-ERBA基因的節(jié)律轉(zhuǎn)錄，繼而Per和Cry蛋白形成復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核，抑制Bmal1/Clock二聚體的活性，構(gòu)成反饋的負(fù)向環(huán)路，產(chǎn)生時(shí)鐘節(jié)律［10-11］（圖1）。 圖1 生物鐘基因的分子運(yùn)行機(jī)制 隨著研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)生物鐘基因的分子運(yùn)行機(jī)制不僅存在于作為中樞的SCN中，在周圍組織（心臟、肝臟、腎臟、成纖維細(xì)胞和外周淋巴細(xì)胞等）也存在生物鐘基因的表達(dá)［12］，也同樣參與調(diào)解各種已分化細(xì)胞或干細(xì)胞內(nèi)獨(dú)特生命活動(dòng)的晝夜節(jié)律。生物鐘基因在細(xì)胞分裂、骨形成、能量代謝、腫瘤形成等多種重要生理過程中起到重要作用。周邊組織的生物鐘受到中樞生物鐘的嚴(yán)密調(diào)控。實(shí)驗(yàn)表明，在SCN破壞的情況下，周邊組織的整體生物節(jié)律也逐漸消失［13］。因此，生物鐘基因在機(jī)體的平衡調(diào)控中起到關(guān)鍵作用。 2 生物鐘基因?qū)歉慕ǖ恼{(diào)控 骨骼系統(tǒng)是機(jī)體的主體系統(tǒng)，是一種高活性組織。骨骼系統(tǒng)的發(fā)生在胚胎早期就已經(jīng)開始，但在之后的一生中還會(huì)不斷改建和更新，以修復(fù)自身微損傷、保持骨組織結(jié)構(gòu)、行使負(fù)重等功能。研究表明，人類每年有10%的骨改建代謝重建，骨骼系統(tǒng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡就是靠骨重建來實(shí)現(xiàn)的［14］。骨形成的過程包括兩種方式：軟骨內(nèi)成骨和骨膜內(nèi)成骨。對(duì)成年期的骨骼來說，骨形成只發(fā)生在骨缺損需要重建的位置。骨改建包括骨吸收和骨形成兩個(gè)方面，涉及到覆蓋在骨骼表面的骨襯細(xì)胞皺縮、破骨細(xì)胞填補(bǔ)位置，并將鈣化的基質(zhì)吸收形成骨陷窩，以及成骨細(xì)胞進(jìn)入骨陷窩重新充填新的骨質(zhì)［15-16］。 近十年來，很多文獻(xiàn)表明了生物鐘基因與骨形成和骨改建存在著聯(lián)系。目前的研究大多還局限在小鼠模型上。生物鐘基因缺失在小鼠上不僅體現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律紊亂，同時(shí)也伴有活動(dòng)減少、體重減輕、生命延長(zhǎng)等表現(xiàn)［17］。有研究顯示，將離體小鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于三維海綿中，通過對(duì)位于骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的細(xì)胞漿、細(xì)胞骨架、細(xì)胞核中的12 000多種基因的DNA微點(diǎn)陣分析發(fā)現(xiàn)：生物鐘基因Clock以及Per1、Per2在軟骨中均有表達(dá)，并呈現(xiàn)典型的晝夜節(jié)律［18］。 近些年的研究發(fā)現(xiàn)，生物鐘基因在骨細(xì)胞中也有表達(dá)，并且調(diào)控骨重建的過程。生物鐘基因Per1、Per2、Cry1、Cry2基因的敲除將會(huì)導(dǎo)致整個(gè)小鼠的骨體積變大，而不會(huì)造成身體組分的改變和其他明顯的代謝紊亂。Per2的功能性敲除導(dǎo)致雌鼠骨體積呈現(xiàn)年齡依賴性增長(zhǎng)［19］。有研究也表明，在Per2-Brdm1突變小鼠中，骨形成速率大量提高，但是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的數(shù)量并沒有增加，可能主要是因?yàn)檎{(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性因子釋放的功能發(fā)生了改變［20］。在Cry2-/-小鼠中，成骨細(xì)胞的活性沒有明顯改變，但是破骨細(xì)胞的活性被降低，從而骨吸收的速率降低，導(dǎo)致這類小鼠有比較高的骨體積［21］，這與在Per2 Brdm1突變小鼠中觀察到的骨表性不同，進(jìn)一步表明生物鐘基因在調(diào)控骨平衡中各自起著不同的作用。 1997年，Ikeda和Nomura研究小組首先命名了Bmal1。Bmal1基因又名Mop3、芳烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白3（aryl-hydrocarbon receptor nuclear translocator 3，ARNT3）基因，是一種調(diào)節(jié)生物節(jié)律的重要轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)產(chǎn)物Bmal1蛋白是正反饋環(huán)路的調(diào)節(jié)因子之一。Honma等［22］的進(jìn)一步研究中，在人的基因組已得到的體外表達(dá)的小段序列中，發(fā)現(xiàn)了Bmal1基因是一段含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋（PAS）結(jié)構(gòu)域的基因序列，并成功的進(jìn)行了克隆。 1999年，Takahashi研究小組發(fā)布了對(duì)人類Clock（hClk）的克隆結(jié)果，得到了人類cDNA 編碼的Clock蛋白。人類Clock蛋白編碼序列為2 538 bp，其中89%與小鼠類似；hClk定位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂（4q12），含20個(gè)外顯子，其內(nèi)含子、外顯子的組成也與小鼠一樣，這將是小鼠模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能同樣適用于人的依據(jù)［23］。 2014年，在小鼠模型組織學(xué)水平的研究中發(fā)現(xiàn)，Clock基因敲除能夠促進(jìn)骨密度的增加，同時(shí)引起骨小梁數(shù)量、厚度、骨體積比以及皮質(zhì)骨厚度的增加，骨小梁間隔變小；Bmal1基因敲除導(dǎo)致骨密度的減少，同時(shí)引起骨小梁數(shù)量、厚度、骨體積比以及皮質(zhì)骨厚度的減少，骨小梁間隔變大。該實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞學(xué)水平上的研究認(rèn)為：Clock基因促進(jìn)骨的生長(zhǎng)和發(fā)育主要是促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和礦化；而Bmal1基因抑制骨的形成和發(fā)育主要從抑制成骨細(xì)胞的分化和礦化以及促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖兩個(gè)方面［24］。 近年，可查到的文獻(xiàn)還僅限于Clock基因和Bmal1基因?qū)歉慕ǖ挠绊懀渌诵溺娀驅(qū)歉慕ǖ挠绊戇€有待進(jìn)一步研究。 3 生物鐘基因與血管生長(zhǎng)的關(guān)系 文獻(xiàn)表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）可以促進(jìn)骨愈合及移植骨內(nèi)成骨［25］。所以，生物鐘基因可能通過影響血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)等方式間接影響成骨。 血管的生長(zhǎng)發(fā)育受到多因子的調(diào)控，如血管生成素1（angiogenin-1，Ang-1）可以穩(wěn)定血管的生長(zhǎng)［26］，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以促使血管出芽［27］。在這些因子的相互作用下，血管會(huì)以特定的方向出芽并逐漸進(jìn)行生長(zhǎng)，并且不斷的重塑最后形成復(fù)雜而有層次的血管網(wǎng)絡(luò)。 2012年，有研究證實(shí)脊椎動(dòng)物體內(nèi)的生物鐘基因可以對(duì)血管生長(zhǎng)發(fā)育起到作用。在斑馬魚體內(nèi)，Per2和Bmal1對(duì)依賴VEGF的血管新生中發(fā)揮相反的作用［28］。2015年，有實(shí)驗(yàn)利用基因敲除的小鼠模型證實(shí)，Per1、Per2和Bmal1基因?qū)φ０l(fā)育階段的小鼠的脈管生長(zhǎng)沒有明顯的作用。該研究認(rèn)為，和斑馬魚模型產(chǎn)生差異的主要原因可能是：第一，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)Bmal1和Per2可能依然可以調(diào)控VEGF的表達(dá)，但是調(diào)控幅度不足以引起明顯血管新生的缺陷；第二，哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在更完善的代償機(jī)制，從而啟動(dòng)其他信號(hào)通路平衡VEGF的表達(dá)，保證正常脈管的發(fā)育；第三，哺乳動(dòng)物體內(nèi)脈管生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制與斑馬魚相比更加復(fù)雜，而這種差異需要更進(jìn)一步的研究和證據(jù)去說明［29］。 4 生物鐘基因與骨改建的研究展望 截至2016年4月24日在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上的關(guān)聯(lián)詞查詢，可見近些年對(duì)于生物鐘基因（Clock gene）與骨改建（Bone remodeling）共同的研究還比較少（圖2）。目前生物鐘基因的研究大多是和腫瘤等疾病相關(guān)，而與調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的文獻(xiàn)較少。研究表明，機(jī)體內(nèi)大約30%基因受生物鐘基因調(diào)控，所以我們可以猜想，骨的改建是與生物鐘基因息息相關(guān)的。 圖2 NCBI關(guān)于生物鐘基因與骨改建的相關(guān)研究統(tǒng)計(jì)（截至2016年4月24日） 研究表明，生物鐘大致是48 h節(jié)律的震蕩方式［30］，而骨的改建是一個(gè)長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)的過程。我們可以猜想骨組織生長(zhǎng)發(fā)育的節(jié)律性是受生物鐘節(jié)律的影響。但是人體長(zhǎng)期骨組織生長(zhǎng)研究中，標(biāo)本采集是很難實(shí)現(xiàn)的，所以大多實(shí)驗(yàn)都僅僅局限于細(xì)胞水平。但是對(duì)于完整人體，細(xì)胞節(jié)律性受到核心生物鐘基因的調(diào)控，單獨(dú)的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)難以說明其在機(jī)體中起到的作用。 當(dāng)今，骨缺損的患者在口腔修復(fù)中很常見，如果能夠探究清楚生物鐘基因?qū)歉慕ǖ恼{(diào)控，就能通過調(diào)控生物鐘基因來獲得更好的骨改建治療效果。試想，如果我們可以通過調(diào)節(jié)飲食睡眠等每天的習(xí)慣，就可以提高修復(fù)骨缺失的治療效果，那么就可以對(duì)骨量不足患者的臨床治療起到很大幫助。關(guān)于生物鐘基因?qū)歉慕ㄓ绊憴C(jī)制我們還知之甚少，但隨著研究的深入，這些結(jié)果必定會(huì)成為我們修復(fù)缺損骨組織的重要研究依據(jù)。 信息來源：口腔醫(yī)學(xué)雜志
029-88651307
