[摘要]  乳牙牙髓干細(xì)胞（SHED）是牙源性干細(xì)胞的一種，屬外胚間充質(zhì)干細(xì)胞。作為一種理想的干細(xì)胞來源，SHED在干細(xì)胞治療中有良好的應(yīng)用前景。本文闡述了SHED的生物學(xué)特征及其在干細(xì)胞治療中的優(yōu)勢(shì)，探討了SHED在組織再生和修復(fù)中發(fā)揮的多向分化潛能、細(xì)胞分泌功能和免疫調(diào)節(jié)功能等方面的功能作用。此外，本文還介紹了SHED在各系統(tǒng)、器官疾病治療中的臨床應(yīng)用，重點(diǎn)闡述了用SHED進(jìn)行干細(xì)胞移植在牙髓—牙本質(zhì)再生、頜骨再生、神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療和免疫系統(tǒng)疾病治療方面的研究進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞] 人乳牙牙髓干細(xì)胞； 干細(xì)胞治療； 臨床應(yīng)用

干細(xì)胞治療的理念是利用干細(xì)胞替代、修復(fù)和加強(qiáng)受損的組織與器官的生物學(xué)功能，達(dá)到組織再生或修復(fù)的目的。獲得合適的干細(xì)胞來源是干細(xì)胞治療的重要部分。Miura等[1]于2003年從脫落乳牙的牙髓中分離培養(yǎng)出人乳牙牙髓干細(xì)胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED），具有自我更新和高度增殖，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，多向分化等間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）的典型生物學(xué)特征。目前，學(xué)者們認(rèn)為，SHED具有多種優(yōu)勢(shì)，在干細(xì)胞治療領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

1，SHED的生物學(xué)特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)

SHED的胚胎發(fā)育起源于神經(jīng)嵴外胚層，這些組織遷徙到頜面部后形成外胚間充質(zhì)[2]。與中胚層來源的MSC不同，SHED具有外胚層組織如神經(jīng)組織的分化優(yōu)勢(shì)。除了MSC的典型標(biāo)志物，如CD146、CD90、CD105、CD73等之外[1,3-4]，SHED還表達(dá)巢蛋白（nestin）、β微管蛋白三（βⅢ-tubulin）、谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）、神經(jīng)元核抗原（neuronal nuclei，NeuN）等多種神經(jīng)元表面標(biāo)志物[1]及胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)志物，如八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（transcription factor Octamer-4，Oct4）、 Nanog、胚胎階段特異性抗原（stage-specific embryonic antigen，SSEA）-3、SSEA-4、腫瘤識(shí)別抗原（tumor recognition antigen，TRA）-1-60和TRA-1-81[5]?？梢娖浼?xì)胞特性的多樣性及復(fù)雜性，也預(yù)示其在多個(gè)領(lǐng)域有應(yīng)用的潛能。   

作為成體干細(xì)胞的一類，SHED具有普遍優(yōu)點(diǎn)[6]：SHED取自將自然替換的乳牙牙髓，來源易得且無創(chuàng)；比胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞所受倫理爭議較少；用于自體移植時(shí)，可有效避免免疫排斥反應(yīng)和免疫抑制劑的使用；移植后致瘤風(fēng)險(xiǎn)較低。由此可見，建立SHED庫方便、安全、可行[7]。

SHED和其他MSC有很多相似之處。SHED的成骨分化潛能與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC）類似[1,8]。SHED與誕生牙、阻生第三磨牙來源的牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cell，DPSC）的形態(tài)、細(xì)胞表面標(biāo)志物及多向分化潛能相似[9]。SHED又具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，具有高度的增殖活性，較DPSC和BMMSC具有更高的增殖活性和群體倍增數(shù)[1,10]，較BMMSC具有更高的端粒酶活性[8]。SHED在免疫調(diào)節(jié)上具有優(yōu)勢(shì)。將SHED、BMMSC分別與外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)，可以發(fā)現(xiàn)，SHED減少白細(xì)胞介素-17T輔助細(xì)胞（interleukin-17 T helper cell，Th17）的數(shù)量、降低白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-17水平的能力更強(qiáng)；給系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）小鼠靜脈注射SHED和BMMSC，可以發(fā)現(xiàn)SHED能更大程度減少外周血中Th17細(xì)胞的數(shù)量和增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory cell，Treg）/Th17細(xì)胞的比例[8]。SHED的成神經(jīng)分化能力較強(qiáng)，體內(nèi)研究[11]表明，SHED在神經(jīng)系統(tǒng)的定植存活和少突膠質(zhì)細(xì)胞的定向分化潛能方面優(yōu)勢(shì)顯著；體外研究[12]顯示，SHED比DPSC表達(dá)更多的神經(jīng)元標(biāo)志物，具有更強(qiáng)的神經(jīng)樣細(xì)胞分化能力。

SHED展示出較好的生物學(xué)穩(wěn)定性和良性特征，相比于臍帶MSC和月經(jīng)血干細(xì)胞，SHED具有較低的凋亡性和衰老性，在第10代仍可保持其梭形細(xì)胞形態(tài)[13]。

2，SHED在干細(xì)胞治療中的功能作用

2.1  干細(xì)胞多向分化潛能

SHED具備多向分化潛能，在合適的條件下可定向分化，發(fā)揮特定細(xì)胞的功能，形成新生組織。

除了分化為經(jīng)典的牙本質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，SHED還具有跨系、跨胚層分化能力。Miura等[1]發(fā)現(xiàn)，SHED具有成神經(jīng)分化潛能。SHED誘導(dǎo)分化形成神經(jīng)球后，經(jīng)進(jìn)一步誘導(dǎo)可形成多巴胺能神經(jīng)元[14]。SHED還可向內(nèi)胚層來源的肝細(xì)胞[15]、胰島素樣細(xì)胞[16]分化。

近年來，對(duì)干細(xì)胞定向分化機(jī)制的研究越趨微觀和精準(zhǔn)。干細(xì)胞的定向分化需要特定細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）與其受體1結(jié)合后作用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）和蛋白激酶BAKT信號(hào)通路，可介導(dǎo)SHED分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞從而形成新生血管[17]。細(xì)胞定向分化的啟動(dòng)與特定的信號(hào)通路有關(guān)，如Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)節(jié)SHED和DPSC成血管分化的開關(guān)，其激活則啟動(dòng)血管分化過程，抑制則反之[18]。

2.2 細(xì)胞分泌功能

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，干細(xì)胞通過細(xì)胞分化作用進(jìn)行組織再生，近年來的研究[19]則發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞更可能通過“旁分泌”和“抗炎作用”修復(fù)受損組織。當(dāng)局部組織受到損傷時(shí)，MSC被激活并分泌多種細(xì)胞因子，發(fā)揮抗凋亡、抗炎、抗瘢痕、促血管生成的作用，形成有利于組織修復(fù)的局部微環(huán)境[20]。

SHED也具備強(qiáng)大的分泌功能，從而形成利于組織再生或修復(fù)的微環(huán)境。在神經(jīng)再生的研究[21-23]中，這一功能體現(xiàn)地較為突出。如在周圍神經(jīng)受損處，SHED可分泌神經(jīng)生長因子（neuron growth factor，NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neuotrophic factor，BDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（neurotrophin-3，NT-3）、 睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）等多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，支持神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移、存活及軸突延長；表達(dá)VEGF促進(jìn)血管再生；分泌細(xì)胞外基質(zhì)的有效成分，如層粘連蛋白、纖維粘連蛋白及Ⅳ型膠原以促進(jìn)細(xì)胞黏附與增殖，從而促進(jìn)神經(jīng)受損處軸突的生長[21]。

干細(xì)胞強(qiáng)大的分泌功能催生出無細(xì)胞療法（cellfree therapy）的理念，即不移植干細(xì)胞而利用干細(xì)胞的分泌物如SHED的條件培養(yǎng)物（SHED conditioned medium，SHED-CM）進(jìn)行治療[23-24]。相對(duì)于干細(xì)胞移植而言，細(xì)胞分泌物可以避免致瘤、免疫排斥和倫理爭議問題。研究[25]發(fā)現(xiàn)，SHED產(chǎn)生的外泌體（exosomes）可抑制6-羥基多巴胺介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

2.3免疫調(diào)節(jié)功能   

MSC具有免疫調(diào)節(jié)功能，具體機(jī)制比較復(fù)雜。MSC可抑制T細(xì)胞，抑制樹突狀細(xì)胞的成熟，減少B細(xì)胞激活與增殖，抑制自然殺傷細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒性，通過IL-10途徑促進(jìn)Treg的產(chǎn)生，從而對(duì)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)和固有免疫系統(tǒng)產(chǎn)生作用。MSC可形成促炎性MSC1型細(xì)胞（應(yīng)激于組織急性損傷）或免疫抑制性MSC2細(xì)胞（抗炎、促進(jìn)愈合），類似單核/巨噬細(xì)胞M1/M2型細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)換[26]。MSC可以加強(qiáng)宿主自身的免疫防御作用[27]。研究[28]表明，人和猴的MSC主要通過2,3-雙加氧酶途徑發(fā)揮免疫抑制作用。    

如前所述，SHED具備免疫調(diào)節(jié)功能上的優(yōu)勢(shì)。SHED-CM可使小膠質(zhì)細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的表型由促炎性M1型轉(zhuǎn)變成抗炎性M2型，抑制CD4+T細(xì)胞增殖及其促炎癥細(xì)胞因子的釋放，且其治療作用與SHEDCM的成分唾液酸結(jié)合Ig樣凝集素9的胞外域（ectodomain of sialic acid-binding Ig-like lectin-9，ED-Siglec-

9）有關(guān)[24]。除了免疫系統(tǒng)疾病，SHED的免疫調(diào)節(jié)功能也可用于其他系統(tǒng)疾病的治療。   

SHED可同時(shí)發(fā)揮細(xì)胞定向分化、細(xì)胞分泌和免疫調(diào)節(jié)等綜合作用。SHED在治療帕金森小鼠時(shí)，可誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元，同時(shí)也分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)揮旁分泌作用[14]。

3，SHED在各器官系統(tǒng)疾病治療中的應(yīng)用

3.1  牙髓—牙本質(zhì)再生

臨床上常見牙髓炎、根尖病變或外傷等原因使得年輕恒牙的牙根繼續(xù)發(fā)育受阻，壽命減損。牙髓再生旨在通過DPSC分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，形成新生牙本質(zhì)、血管及神經(jīng)，促進(jìn)牙髓活力恢復(fù)及牙根的繼續(xù)發(fā)育，是治療年輕恒牙牙髓病變的新思路。

近年來，學(xué)者們廣泛研究了SHED、根尖周牙乳頭干細(xì)胞（stem cells from apical papilla，SCAP）和DPSC在牙本質(zhì)—牙髓組織工程再生中的作用。在體內(nèi)，SHED不僅可存活、增殖并形成牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)[1]，還可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞和內(nèi)皮樣細(xì)胞并形成含血管網(wǎng)的似生理性牙髓樣結(jié)構(gòu)[29]。研究[17]證實(shí)，SHED可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，前者可分泌牙本質(zhì)涎磷蛋白與牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1，并形成管狀牙本質(zhì)，后者可形成和宿主脈管相連的功能性血管。在組織工程牙髓再生的研究[30]中，將SHED和生物支架（Puramatrix™或 rhCollagen type Ⅰ）置入全長根管后移植到裸鼠背部皮下，發(fā)現(xiàn)SHED可分化成具有分泌功能的成牙本質(zhì)細(xì)胞，并形成和正常牙髓的細(xì)胞、血管組分類似的功能性牙髓和管狀牙本質(zhì)。這些都是異位牙髓再生的研究，目前還需要進(jìn)一步探索SHED在口腔環(huán)境中介導(dǎo)牙髓—牙本質(zhì)再生的能力。

3.2  頜骨再生

口腔頜面外科診療中，常見因外傷、腫瘤、炎癥、先天發(fā)育畸形、牙周疾病等導(dǎo)致頜骨缺損的情況，需要進(jìn)行口頜面骨再生。利用干細(xì)胞的成骨能力，進(jìn)行組織工程骨再生是修復(fù)頜骨缺損的新策略。SHED與頜面骨、顱骨皆起源于神經(jīng)嵴，對(duì)于頜面骨、顱骨缺損修復(fù)是一個(gè)合適的干細(xì)胞源。

和BMMSC類似，SHED具有良好的成骨能力[1]。將犬的SHED與富血小板血漿的混合物植入犬下頜骨缺損處，可形成與DPSC、BMMSC植入相似的血管化成熟骨組織[31]。研究[32]發(fā)現(xiàn)，SHED-CM在體外可促進(jìn)種植體表面磷酸鈣鹽和胞外基質(zhì)蛋白的沉積，進(jìn)而促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的黏附；在體內(nèi)可刺激種植體周圍新骨形成。Jahanbin等[33]研究表明，將成骨誘導(dǎo)分化后的SHED和支架膠原蛋白基質(zhì)一起植入到鼠的上頜牙槽骨缺損處，可介導(dǎo)新骨形成，治療效果和自體髂骨移植類似。

3.3  神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療    

神經(jīng)系統(tǒng)的再生修復(fù)能力有限，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦卒中、外傷、退行性病變、腫瘤、炎癥等，藥物、手術(shù)等治療方式不能從根本上解決受損神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能重建問題，干細(xì)胞療法是十分有希望的治療方式。與神經(jīng)系統(tǒng)有共同胚胎發(fā)育起源的牙源性干細(xì)胞SHED成為研究熱點(diǎn)。

SHED有望用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的治療。將SHED和SHED誘導(dǎo)后形成的神經(jīng)球定位注射到帕金森病大鼠模型紋狀體，發(fā)現(xiàn)兩者皆可在大鼠模型的腦內(nèi)存活，并改善其行為障礙[14]。將未分化SHED或經(jīng)誘導(dǎo)神經(jīng)分化的SHED（induced SHED，iSHED）植入脊髓挫傷鼠的脊髓損害處，可促進(jìn)其運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，且iSHED組較SHED組的運(yùn)動(dòng)功能改善更明顯[22]。局部注射SHED可改善完全橫斷性脊髓損傷鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能，效果和DPSC移植組類似，且優(yōu)于BMMSC和成纖維細(xì)胞移植組[11]。通過鼻腔給藥將SHED-CM用于中動(dòng)脈閉塞大鼠的治療，可見內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞向組織損傷區(qū)的遷移與分化，恢復(fù)運(yùn)動(dòng)功能并減輕缺血性腦損傷的面積[23]。

此外，SHED也可用于周圍神經(jīng)系統(tǒng)病變的治療。SHED-CM局部用于鼠坐骨神經(jīng)離斷處，可增加軸突密度和有髓鞘神經(jīng)纖維的數(shù)量，促進(jìn)坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)，減少肌肉萎縮[21]。

3.4 免疫系統(tǒng)疾病治療    

MSC具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能，在抗自身免疫反應(yīng)、抗炎和腫瘤治療等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用的潛能。SHED具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能，已成為免疫治療的新熱點(diǎn)。   

給SLE小鼠靜脈注射SHED，可以改善小鼠的SLE紊亂癥，如降低自身抗體水平，改善腎臟功能指標(biāo)[8]。將凍存牙髓中分離的SHED進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也得到類似結(jié)果[34]。用SHED-CM治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎鼠，可見鼠的疾病癥狀明顯改善，脊髓中神經(jīng)脫髓鞘和軸突損傷減輕，炎癥性細(xì)胞浸潤和促炎細(xì)胞因子分泌減少[24]。

3.5其他方面

SHED用于其他系統(tǒng)疾病的治療研究僅有少數(shù)報(bào)道。SHED可重建兔眼角膜缺損處的角膜上皮表面，改善角膜透明度[35-36]；還可促進(jìn)創(chuàng)口愈合[37-38]。在鼠纖維化肝臟中，SHED可替代受損肝細(xì)胞，發(fā)揮抗纖維化、抗炎作用，促進(jìn)肝功能的恢復(fù)[39]。SHED可以逆轉(zhuǎn)糖尿病屬的疾病癥狀，并促進(jìn)鼠正常血糖含量的恢復(fù)[40]。還有研究顯示，SHED可促進(jìn)急性肺損傷鼠的組織修復(fù)[41]，減輕急性腎損傷鼠的炎癥[42]。

綜上所述，SHED取自將自然替換的乳牙牙髓，來源易得無創(chuàng)，便于建立干細(xì)胞庫，較少涉及倫理爭議，在機(jī)體中可發(fā)揮定向分化、細(xì)胞分泌功能、免疫調(diào)節(jié)等多方面功能作用，是十分理想的干細(xì)胞來源。

來源：原創(chuàng)  李曉霞 葛立宏等 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志