專家介紹

葉玲，女，教授，博士生導(dǎo)師。主要從事牙體牙髓病學(xué)臨床醫(yī)療、教學(xué)和科研工作，擅長牙髓根尖周病的現(xiàn)代診治及疑難病例的治療。致力于牙髓病病因和防治及牙髓生物學(xué)的研究，以牙齒發(fā)育中的信號通路研究和牙再生為主研方向。發(fā)表論文60余篇，其中SCI期刊收錄30余篇，主編專著2部，參編專著10部。負(fù)責(zé)和參與國家自然科學(xué)基金、國際合作項目等重大科研課題10余項。參研課題獲教育部高等學(xué)?？萍歼M(jìn)步獎一等獎；四川省科技進(jìn)步獎一等獎，四川省醫(yī)學(xué)科技獎一等獎，中華口腔醫(yī)學(xué)科技獎三等獎。獲國家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年基金、教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支撐計劃和四川省杰出青年科技基金資助，為四川省學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人。

［摘要］  再生性牙髓治療是基于生物學(xué)基礎(chǔ)治療的一種方法，目的是替換受損的部分牙髓組織或允許牙髓樣組織形成以完全替代原牙髓組織。針對牙髓炎或牙髓壞死的年輕恒牙的治療，研究者們利用口腔來源干細(xì)胞或根尖周組織的干細(xì)胞建立各種利于修復(fù)的微環(huán)境，提出了如牙髓血運(yùn)重建術(shù)/干細(xì)胞歸巢治療等充滿前景的新治療技術(shù)，從而為牙髓的再生提供了大量研究資料及可選治療手段。該文對再生性牙髓治療方法的現(xiàn)狀及其發(fā)展前景作一綜述。

［關(guān)鍵詞］  年輕恒牙；再生性牙髓治療；干細(xì)胞；牙髓血運(yùn)重建

再生性牙髓治療是基于生物學(xué)的一種治療方法，目的是替換受損的部分牙髓組織或允許牙髓樣組織形成以完全替代原牙髓組織［1］。從最初的直接蓋髓和間接蓋髓治療，到規(guī)范化的牙髓血運(yùn)重建術(shù)治療，以及生長因子誘導(dǎo)的基于細(xì)胞歸巢理論的牙髓再生治療，再生性牙髓治療越來越受到關(guān)注。過去十多年有關(guān)再生性牙髓治療和牙髓再生組織工程的研究非常多，也取得了很大的進(jìn)步，其中大量的工作是將某些類型的干細(xì)胞置于支架上，放進(jìn)患牙的根管系統(tǒng)內(nèi)，通過添加生長因子（外源性的，或來自牙本質(zhì)和/或殘留牙髓組織），從而獲得牙髓樣組織形成［2］。但是仍存在很多問題未解決，除了對支架、血管組織、生長因子、信號機(jī)制、細(xì)胞遷移和分化等的要求不甚清楚之外，牙髓形成和再生過程中的具體時間段和生物學(xué)機(jī)制也尚未完全清楚。如何恢復(fù)原位的牙髓和牙本質(zhì)發(fā)育，形成有效的、安全的治療方案，還有很長的路要走，本文將對再生性牙髓治療的研究進(jìn)展作一綜述。

1  再生性牙髓治療方法的發(fā)展

再生性牙髓治療已被定義為一種基于生物學(xué)的治療方法，目的是替代受損的組織，包括牙本質(zhì)和牙根的支持組織，以及牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體包含的細(xì)胞［1］。再生性牙髓治療的可能性很大程度上依賴于生物學(xué)治療的發(fā)展，運(yùn)用組織工程的基本原則，從時空上有效地調(diào)控干細(xì)胞、生長因子和骨架，從而獲得牙髓組織的功能性再生。再生性牙髓治療方法在過去曾被命名為血運(yùn)重建術(shù)（revascularization）、牙髓活化（revitalization）或再生性牙髓治療（regenerative endodontics），為了統(tǒng)一稱呼，參考Diogenes等［3］的方法統(tǒng)稱為再生性牙髓治療方法（regenerative endodontic procedures, REPs），本文中的REPs包括了旨在實(shí)現(xiàn)牙髓組織修復(fù)的所有治療過程，而不是特指某種治療方式。

1961年Nygaard-stby等［4］第一次觀察到根管內(nèi)血凝塊的存在可以促進(jìn)愈合，對活髓或死髓的發(fā)育成熟牙齒通過擴(kuò)大根尖孔、封藥（牙髓壞死病例）、刺激根管內(nèi)出血形成血凝塊、暫封。組織切片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，因為根尖孔擴(kuò)大和器械超預(yù)備，在早期（17 d時）可以看到炎癥反應(yīng)，幾乎所有病例都觀察到根管內(nèi)有結(jié)締組織長入，且沿著根管壁有不同程度的礦化組織，“島樣”的礦化組織包埋在新形成的組織里，X線檢查也提示有根尖封閉。雖然牙髓組織本身就是一種富含成纖維細(xì)胞的結(jié)締組織，但是長入的結(jié)締組織里卻缺乏期望的細(xì)胞類型如成牙本質(zhì)細(xì)胞，并有非期望的細(xì)胞類型如成牙骨質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果提示該操作方法不能獲得完全意義的牙髓組織再生。雖然存在缺點(diǎn)，該先驅(qū)性研究為隨后的再生性牙髓治療奠定了基礎(chǔ)。

1966年Rule等［5］第一次建立采用多抗生素糊劑抗感染的根管消毒體系，除了采用多抗生素封藥，并不主動刺激根管內(nèi)出血，而是有意不破壞根尖周的活組織，結(jié)果報告的5例死髓年輕恒牙的臨床癥狀均有改善，且牙根均繼續(xù)發(fā)育。

1971年Nygaard-stby等［6］結(jié)合使用多抗生素糊劑抗感染和刺激根管內(nèi)出血的方法治療牙髓壞死的年輕恒牙，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牙齒的癥狀普遍消失且牙根普遍繼續(xù)發(fā)育。然而，對拔除牙齒的組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，雖然80%的牙齒里都有結(jié)締組織生成，但只有50%的牙齒有牙骨質(zhì)形成。該方法能獲得可接受的臨床治療效果（消除根尖周炎癥狀），但僅有牙髓的部分生成?？傊?，該發(fā)現(xiàn)為建立一個當(dāng)代REPs的操作規(guī)范奠定了基礎(chǔ)，并提示年輕恒牙壞死牙髓的修復(fù)過程可以在根管消毒后進(jìn)行，可能與消毒過程對根尖周干細(xì)胞沒有明顯影響有關(guān)。

沉寂30年后，2001年［7］報道當(dāng)代第1例REPs病例，針對牙髓壞死的年輕恒牙的治療：不采用器械預(yù)備，用雙聯(lián)抗生素糊劑（double antibiotics paste, DAP）（甲硝唑，環(huán)丙沙星）消毒根管，經(jīng)歷多次化學(xué)清理和根管封藥，牙根得以繼續(xù)發(fā)育，30個月回訪時牙髓活力測試呈陽性，但髓室及根管空間明顯減小。隨后Banchs等［8］在2004年建立REPs處理流程，第一次就診，用5.25%次氯酸鈉反復(fù)沖洗清理根管系統(tǒng)而不預(yù)備根管，放置抗生素三聯(lián)糊劑（triple antibiotics paste, TAP）（環(huán)丙沙星，米諾環(huán)素，甲硝唑）消毒28 d；第二次就診，去除封藥，生理鹽水沖洗，刺激根管內(nèi)出血，血凝塊上放置充填材料等。該病例報告中的下頜前磨牙最終牙根發(fā)育成熟，且牙髓活力測試呈陽性。隨后經(jīng)歷多次操作步驟的完善和修改，目前臨床常采用的操作步驟多參考美國牙髓病學(xué)會（American Association of Endodontics，AAE）提供的完整步驟（https://www.aae.org/uploadedfiles/publications_and_research/research/currentregenerativeendodonticconsiderations.pdf），該步驟最新更新于2016年6月8號。

目前有關(guān)REPs的研究大多是病例報告，缺乏隨機(jī)對照試驗，雖有一定缺陷，但還是解決了關(guān)于“牙髓壞死的年輕恒牙的治療成功必須包括牙根的持續(xù)發(fā)育”這個問題，為未來REPs采用干細(xì)胞、支架、生長因子等組織工程要素來實(shí)現(xiàn)再生性牙髓治療明確了發(fā)展方向。

2  再生性牙髓治療方法的分類及適應(yīng)證

目前而言，針對牙髓壞死和不可逆性牙髓炎的年輕恒牙REPs大致包括血運(yùn)重建術(shù)和再生性牙髓治療術(shù)，基本操作方法都是清理根管組織，采用抗生素或/和抗菌藥物行根管消毒，血運(yùn)重建術(shù)要用器械通過開放的根尖孔刺激根尖周組織出血進(jìn)入根管內(nèi)，從而產(chǎn)生血運(yùn)重建，最終促進(jìn)根管內(nèi)形成牙髓組織并繼續(xù)礦化形成牙本質(zhì)和牙根繼續(xù)發(fā)育；而再生性牙髓治療術(shù)會在根管內(nèi)加入支架材料或其他生物因子而不依賴刺激出血，以促進(jìn)活髓組織形成。

REPs的適應(yīng)證，目前集中在牙髓壞死或不可逆性牙髓炎的年輕恒牙。根尖誘導(dǎo)成形術(shù)（apexification）曾是治療壞死牙髓或不可逆性牙髓炎的年輕恒牙最常用、最標(biāo)準(zhǔn)的方法，但是采用根尖誘導(dǎo)成形術(shù)的牙齒牙根發(fā)育不能繼續(xù)，從而牙根短且根管壁牙本質(zhì)薄弱。因此，對于牙本質(zhì)壁薄易于折裂的病例來說，根尖誘導(dǎo)成形術(shù)不合適，而血運(yùn)重建術(shù)和再生性牙髓治療術(shù)能促使牙根繼續(xù)發(fā)育，牙本質(zhì)繼續(xù)形成，從而減少牙根折裂的可能性。

由于REPs的成功依賴于根管內(nèi)組織自身的修復(fù)能力［9］，嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病，可能影響組織的修復(fù)能力，應(yīng)該排除。譬如從患者的病史推測出患者存在自身愈合能力不良，應(yīng)該考慮不依賴于組織再生的牙髓治療手段。患者依從性是REPs的重要因素，會影響REPs的成功率。因為此項治療耗時長，涉及多次復(fù)查和多項檢查，需要良好的患者依從性，如果患者有經(jīng)常失約的不良記錄，則應(yīng)該排除［10］。牙齒本身的狀況，如外傷的程度和齲損的范圍，應(yīng)在術(shù)前進(jìn)行考慮，如后續(xù)修復(fù)的方法可只用冠修復(fù)或樹脂修復(fù)的損傷牙齒，可以考慮行再生性牙髓治療。然而，如果牙折很復(fù)雜且同時涉及牙冠和牙根，考慮到有從折裂處發(fā)生微滲漏的高風(fēng)險，則不能采用再生性牙髓治療。又如牙齒的松動度，因為牙齒松動度過大會導(dǎo)致牙齒支持結(jié)構(gòu)損害而可能導(dǎo)致牙齒脫落，只有牙周膜健康的牙才能納入再生性牙髓治療的范疇［11］。

在決定是否選擇REPs，及選擇哪種牙髓治療方法是保留患牙的最佳方式時，根尖孔的直徑是關(guān)鍵因素。發(fā)育基本完成的牙齒，根尖孔較小會限制血流進(jìn)根管內(nèi)，而血流受限的牙齒不太適合行血運(yùn)重建術(shù)和牙髓再生術(shù)，因為血流太少不足以在根管內(nèi)形成新的組織。有研究發(fā)現(xiàn)在根管內(nèi)實(shí)現(xiàn)牙髓組織再血管化，根尖孔直徑需要至少1.1 mm以上［12］，而且需要大量的間充質(zhì)干細(xì)胞從根尖孔轉(zhuǎn)移至根管內(nèi)［13］，從而形成新的活髓組織。如果根尖孔直徑小于1.1 mm，則不建議采用根管血運(yùn)重建術(shù)或牙髓再生治療方法，同時也不建議為了能采用血運(yùn)重建或牙髓再生的方法而用器械預(yù)備過分?jǐn)U大根尖孔（更容易削弱年輕恒牙牙根的強(qiáng)度從而更易于牙根折裂）。未來或許可以在成年恒牙根管內(nèi)實(shí)現(xiàn)牙髓再生，但就目前來說，對于根尖孔發(fā)育基本完成的牙齒，常規(guī)根管治療還是最好的治療方法。雖然目前的研究多針對根尖孔敞開的年輕恒牙，但隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展及醫(yī)生患者對于活髓牙的追求，REPs的目的可能會變?yōu)楂@得活髓組織而不僅僅是為了獲得牙根的繼續(xù)發(fā)育，未來的適應(yīng)證或許可以放寬到成年恒牙的活髓治療。

年齡方面，也是REPs需要考慮的影響因素。一般患者到18歲時，除第三磨牙，所有的牙齒都已發(fā)育成熟，有足夠長的牙根，足夠厚的牙本質(zhì)壁和接近封閉的根尖孔，而因此建議可以行再生性牙髓治療的最佳時間段為7~17歲［11］。從血供角度看，與年輕人相比，成人的血供明顯不足；從干細(xì)胞的角度看，與年輕人相比，成人的牙髓干細(xì)胞其分化潛能，生物學(xué)特性如穩(wěn)定性、再生潛能、衰老標(biāo)記物的表達(dá)等方面均無明顯差異；從干細(xì)胞自體移植的動物實(shí)驗結(jié)果看，年輕狗的再生牙髓組織生成僅略多于年老狗［14］?？紤]到有患者20歲時仍獲得了牙髓再生性治療的成功［15］，也有患者44歲時仍獲得了牙髓再血管化治療的成功［6］，所以年齡或許并不是一個決定性因素，而只是個影響因素，因此在排除其余禁忌證，嚴(yán)格控制感染和刺激出血的情況下，可以嘗試放寬對根尖孔未發(fā)育完全的患者年齡范圍。

3  再生性牙髓治療的相關(guān)機(jī)制研究

3.1  牙髓修復(fù)過程與牙髓再生過程

牙髓修復(fù)是個愈合過程，其驅(qū)動因素來自殘留的活髓細(xì)胞的自身功能，殘留的受損牙髓組織是有活力的，原始的成牙本質(zhì)細(xì)胞也還存活，且牙髓組織能恢復(fù)到一個正常的結(jié)構(gòu)形式和功能。隨著成牙本質(zhì)細(xì)胞被再激活，牙本質(zhì)基質(zhì)形成，然后礦化（形成反應(yīng)性牙本質(zhì)），殘留牙髓保有大部分生物學(xué)功能。而牙髓再生，表明牙髓已經(jīng)完全壞死崩解，需要形成新的“牙髓樣組織”且可能與原始的組織功能一致。牙髓再生過程中，需要形成新的牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體，譬如牙髓壞死合并根尖周缺損的年輕恒牙，治療過程包括去除感染和治愈缺損，還需要牙根發(fā)育，形成新的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞并發(fā)揮功能形成牙髓樣組織［1,16-17］。新的“牙髓樣組織”雖然能繼續(xù)形成硬的牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，但一般都沒有牙本質(zhì)小管形成（按照修復(fù)性牙本質(zhì)的形成理論），且根管空間的封閉看起來是一個會快速發(fā)生的過程［18］。如此迅速的進(jìn)展，有別于生理性的增齡性變化和牙髓修復(fù)過程，后續(xù)可能需要進(jìn)一步治療干預(yù)，包括根管治療或根尖外科手術(shù)。如何控制該進(jìn)程的發(fā)展，從而產(chǎn)生一個更自然的組織反應(yīng)過程，而不發(fā)生根管空間被過早封閉的問題，最終減少進(jìn)一步治療干預(yù)的必要性，達(dá)到真正意義上的牙髓再生［19］？

理想化的目標(biāo)是：牙髓再生過程應(yīng)該模仿繼發(fā)性牙本質(zhì)形成的生理性的發(fā)育過程，該過程是發(fā)生在未累及牙髓組織，作為老齡化進(jìn)程中自然發(fā)生的一個過程，最終生成不礦化的牙髓組織。牙髓再生的次級目標(biāo)是生成一個類牙髓組織，最終可能形成一個完全礦化的根管系統(tǒng)從而替代根管治療，而不需要完全接近天然牙。目標(biāo)不同，要求不同，相同的是都要具有生物工程化治療方法的有效性［19］。目前對于這個問題的研究還處于“知其然不知其所以然”的階段，牙髓發(fā)育生物學(xué)的基礎(chǔ)研究有助于進(jìn)一步控制牙本質(zhì)形成過程，從而真正實(shí)現(xiàn)牙髓再生的目標(biāo)。

3.2  干細(xì)胞

2001年，Lovelace等［13］首次證明REPs是基于干細(xì)胞的治療方式，該研究發(fā)現(xiàn)在再生性牙髓治療過程中，引血過程會導(dǎo)致大量的未分化間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）進(jìn)入根管內(nèi)，MSCs標(biāo)記物如CD73，CD105的基因表達(dá)有高達(dá)600倍的增高（對照組為正常全血）。除此之外，從臨床樣本中收集的這些細(xì)胞采用激光共聚焦顯微鏡檢測，發(fā)現(xiàn)為CD105和STRO-1陽性。雖然該研究并沒有評估REPs中檢測到的MSCs是否來自根尖牙乳頭，但從引血步驟會撕裂根尖牙乳頭組織推測，這些細(xì)胞很可能就是根尖牙乳頭區(qū)干細(xì)胞（stem cell from the apical papilla, SCAP）。

再生性牙髓治療過程中能應(yīng)用的干細(xì)胞應(yīng)具備自我更新、多譜系分化能力、安全性、無免疫原性等特性。目前研究表明，口腔組織中可用于REPs的干細(xì)胞為根尖周區(qū)域的干細(xì)胞，包括牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells, DPSCs），人脫落乳牙干細(xì)胞(Stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)，SCAP，牙周膜干細(xì)胞(periodontalligament stem cells,PDLSCs)，炎性根尖周前體細(xì)胞（inflamed periapical progenitor cells, iPAPCs），骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）等。DPSCs從牙髓中分離出來，并能再生出新的干細(xì)胞系再分化成其余多種細(xì)胞系［20］。SHED是來源于脫落的人乳牙中干細(xì)胞類型，相對于從拔除的第三磨牙里獲得成體干細(xì)胞而言，SHED具有易獲取性，且有潛力向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞方向分化［21］。PDLSCs、牙囊干細(xì)胞(dental follicle stem cells,DFSCs)的主要功能則是形成牙骨質(zhì)。SCAP來自發(fā)育中的牙齒根部的牙乳頭，牙乳頭是牙髓的前體。2006年Sonoyama首次鑒定SCAP，證明其擁有很強(qiáng)的增殖和成牙分化能力，隨后對根尖乳頭特征和SCAP性質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)SCAP受赫氏上皮根鞘(Hertwig‘’s epithelial root sheath,HERS)調(diào)控，一系列的上皮-間充質(zhì)交互作用會引導(dǎo)牙根發(fā)育和成形，使其在牙根繼續(xù)發(fā)育的研究中更有價值［22-24］。雖然DPSCs和SCAP都能分化成成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，且有能力（潛力）遷移分化形成三維的牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，然而SCAP和DPSCs相比之下，擁有更高的增殖分化能力，從大量凍存細(xì)胞和更高的礦化效率能縮短進(jìn)程的觀點(diǎn)考慮，SCAP應(yīng)用于牙髓組織修復(fù)和再生更具優(yōu)勢［25］。

干細(xì)胞應(yīng)用過程中，首要問題是哪些表面特異性標(biāo)記物陽性表達(dá)的細(xì)胞可以被收集和擴(kuò)展(如Stro-1，CD146/MUC18，CD44等)，從而維持干性和克隆形成能力，從而誘導(dǎo)成牙髓？選擇干細(xì)胞，如同選擇體內(nèi)治療方法，目前尚沒有定論，而且是否需要高純度的干細(xì)胞參與牙髓再生過程，也沒有研究支持。另一個基礎(chǔ)問題是：植入的干細(xì)胞會誘導(dǎo)出哪種牙髓樣組織？這涉及到干細(xì)胞種類的選擇，譬如DPSCs雖然體外發(fā)育能力有限，但植入體內(nèi)實(shí)驗時DPSCs可以形成牙本質(zhì)牙髓樣組織如牙本質(zhì)樣和牙髓樣結(jié)構(gòu)，其形成能力有一定局限性［26］。而BMSCs雖然體外分化能力更強(qiáng)，但植入后可能會形成非期望的非牙體組織，其成牙潛能不如DPSCs［27］。從目前研究結(jié)果看，SCAP是最有希望成為牙髓再生性治療的干細(xì)胞來源，首先是SCAP在炎性狀態(tài)下和消毒處理過程中存活能力較高，這可能與根尖牙乳頭區(qū)血管密度明顯低于牙髓區(qū)有關(guān)，其次是SCAP在HERS的作用下可以分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞并形成牙根。未來，隨著誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, iPS)技術(shù)的發(fā)展，也可能有無創(chuàng)或微創(chuàng)獲得合適干細(xì)胞的方法，并在體外進(jìn)行分化誘導(dǎo)，再聯(lián)合應(yīng)用并生成牙齒結(jié)構(gòu)［28］。為了能夠在臨床上使用這些細(xì)胞系，今后的轉(zhuǎn)化研究將需要研究人員和熟練的臨床醫(yī)生一起開發(fā)出可以最終在臨床環(huán)境中回答這些問題、并進(jìn)行測試和使用的新治療方法。

3.3  支架

支架被認(rèn)為是一種用于組織工程的三維結(jié)構(gòu)或支持物，當(dāng)干細(xì)胞接種在支架上時，干細(xì)胞被期望可以粘附、增殖、分化、分泌基質(zhì)并形成新的組織，并最終取代支架本身。支架應(yīng)該具有生物相容性，不能誘發(fā)炎癥反應(yīng)，不能有細(xì)胞毒性，支持細(xì)胞組織化和血管化，允許新的再生組織形成，可消毒，穩(wěn)定維持機(jī)械形式和強(qiáng)度。支架還應(yīng)該有可以附加生長因子和形態(tài)因子的誘導(dǎo)能力，從而促進(jìn)更快的細(xì)胞粘附，增殖，遷移和分化成特定組織。

使用生物相容性支架，有利于創(chuàng)造牙髓再生的微環(huán)境。誘導(dǎo)根尖組織出血形成血凝塊作為支架是目前牙髓血運(yùn)重建中的主要方法。血凝塊不僅可以選擇性吸附細(xì)胞，本身還為干細(xì)胞提供支架和生長因子，因而能促進(jìn)細(xì)胞的功能性分化和硬組織形成。目前替代血凝塊的血小板濃縮制品主要有以下幾種：富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）、富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF）、濃縮生長因子（concentrate growth factors,CGF）均為通過離心自體全血而得到的血小板濃縮物，具有自體源性、易制取、可降解及形成三維纖維支架等特點(diǎn)，較血凝塊含更豐富的生長因子，如血小板衍生因子（Platelet Derived Growth Factor，PDGF) 、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor,TGF)、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF）等，生長因子能促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖、分化，從而形成基質(zhì)并礦化。PRP和PRF均是能代替血凝塊的理想支架，在根管血運(yùn)重建的臨床應(yīng)用中有著良好的前景，多項病例報告就臨床表現(xiàn)、影像學(xué)和組織學(xué)的研究結(jié)果顯示，使用PRP（富血小板血漿）作為支架治療根管再生后出現(xiàn)“活髓樣結(jié)締組織”，提示PRP應(yīng)用于牙髓再生性治療獲得成功［29-31］。最新的臨床研究結(jié)果表明，用于牙髓再生性治療時，PRF的效果優(yōu)于血凝塊和PRP［32］。GEM21S是富含血小板衍生因子BB（Platelet Derived Growth Factor-BB，PDGF-BB)的一種生長因子增強(qiáng)基質(zhì)，商品化能用于根尖周骨質(zhì)修復(fù)的產(chǎn)品，具備可操作性，且PDGF能顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖、分化，使商品化的GEM-21S或類似物有應(yīng)用于臨床的可能，目前已有病例報告證明其應(yīng)用于牙髓再生性治療的可行性［15，33］。

目前可應(yīng)用于臨床的支架種類較少，而實(shí)驗室研究中支架選擇則較為廣泛，包括天然或合成的聚合物、細(xì)胞外基質(zhì)、自組裝系統(tǒng)、水溶膠、生物活性陶瓷等，盡管支架的種類越來越多，問題卻依然沒有解決。譬如，支架能否支持不同種類的干細(xì)胞？干細(xì)胞種植在不同支架上，結(jié)果是否會類似？使用一種或多種類的天然或合成支架的局限性是什么？使用自組裝肽水凝膠系統(tǒng)允許一種自下而上的方法去生成ECM材料，還允許各種附加設(shè)計，從而提供分子水平的高度調(diào)控，對構(gòu)建未來的支架有積極意義［34］。隨著3D打印技術(shù)的發(fā)展，今后或許可以通過精確放置細(xì)胞和創(chuàng)造組織結(jié)構(gòu)來模仿牙髓組織結(jié)構(gòu)，從而應(yīng)用于牙髓再生性治療。

3.4  生長因子

生長因子是肽類分子，傳播信號從而控制細(xì)胞行為和活性，它們通過與位于細(xì)胞表面的特異性受體交互作用，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖或遷移分化，生長因子與牙齒形態(tài)形成過程中的分子事件，以及牙髓對齲齒、微生物及其他有害刺激做出的反應(yīng)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)生長因子存在于牙本質(zhì)的基質(zhì)中［18,35］，再生性牙髓治療過程中的關(guān)鍵生長因子有骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogentic,BMP），TGF-β，F(xiàn)GF，PDGF，IGF等。PDGF、粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor, G-CSF）和基礎(chǔ)成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor, b-FGF）能顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖、分化，是能應(yīng)用于牙髓再生的潛在靶向目標(biāo)［15,36］。

生長因子應(yīng)用的主要問題是，不同來源的干細(xì)胞需要不同的生長因子誘導(dǎo)以實(shí)現(xiàn)特定的分化，而目前調(diào)控牙向分化的特定生長因子還未明確［37］。除了安全性，生長因子的導(dǎo)入量和導(dǎo)入時間也是一個問題，很難模擬牙髓發(fā)育過程中生長因子的時空表達(dá)情況。為解決這個問題，目前傾向于通過使用仿生ECM嵌入式支架，該支架可以大量生產(chǎn)，無免疫反應(yīng)且不需要任何外源性生長因子［38］。生長因子應(yīng)用的另一個問題是應(yīng)用時往往需要較高的生長因子濃度以補(bǔ)償它們的生理溶解度，可能會導(dǎo)致不必要的副作用和有限的空間控制。采用含有生長因子的微?；蛭⒛z囊來控制細(xì)胞的活性，亦或?qū)⑦@些生長因子與支架結(jié)合在一起形成緩釋系統(tǒng)，或許可以解決這個問題。另外，牙髓發(fā)育過程中關(guān)鍵生長因子的時空表達(dá)模式的相關(guān)研究雖然已經(jīng)完成，但研究結(jié)果仍然不能保證牙髓再生和修復(fù)過程中不發(fā)生牙髓腔體積的減小，因為繼發(fā)性牙本質(zhì)的形成被認(rèn)為是生理性的，且整個生命過程中都在發(fā)生，而外源性生長因子的加入需要模擬這種表達(dá)方式，從而允許正常的進(jìn)程發(fā)生在無修復(fù)體和齲齒、刺激的原生態(tài)牙上，這樣勢必會影響生長因子的臨床應(yīng)用。如前所述，如果REPs的目標(biāo)是替代根管治療形成根尖封閉，那么生長因子的應(yīng)用前景則不會那么受限。

3.5  牙髓炎癥與再生

目前對于牙髓炎癥和牙髓再生的機(jī)制已了解很多，但大部分的研究都將兩者分開研究［39］，且炎癥過程多被視為再生發(fā)生過程的對立面。最近的證據(jù)表明，隨著炎癥的發(fā)展，再生過程可能會受到阻礙，如慢性炎癥階段會引起修復(fù)機(jī)制的抑制狀態(tài)；然而，如果炎癥反應(yīng)水平很低，則可能促進(jìn)再生機(jī)制包括干細(xì)胞生成血管的過程［40］。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)感染處于相對早期或感染被消除時，細(xì)胞因子處于相對低的濃度水平，該濃度下的促炎因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）、活性氧類（reactive oxygen species, ROS），能上調(diào)某些信號通路如P38 MAPK信號，促進(jìn)干細(xì)胞分化和礦化過程，以及牙本質(zhì)涎蛋白(dentin sialoprotein, DSP)和牙本質(zhì)磷蛋白(dentin phospho protein,DPP)的表達(dá)［41］。牙髓炎癥過程中，高水平的細(xì)胞因子和生長因子如TNF-a、TNF-b、牙本質(zhì)基質(zhì)成分等，則會導(dǎo)致牙髓細(xì)胞死亡，并啟動干細(xì)胞分化過程［42］。另外有研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)能對牙髓修復(fù)產(chǎn)生正面影響，如通過免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和樹狀突細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子從而刺激成牙本質(zhì)細(xì)胞分化［43-44］。事實(shí)上，局部來源的生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子，除了存在于牙源性組織ECM，也存在于牙髓細(xì)胞、免疫細(xì)胞或壞死的宿主牙髓組織，且對組織里的細(xì)胞事件有重大影響［19］。

更多的有關(guān)炎癥和再生關(guān)聯(lián)的間接證據(jù)，來自于修復(fù)充填材料能促進(jìn)體內(nèi)牙髓再生的治療方法。氫氧化鈣和三氧化物多聚體(mineral trioxide aggregate,MTA)都是已知能刺激牙本質(zhì)橋形成、啟動治愈過程的生物材料，但這些材料釋放的羥基離子，可以升高缺損區(qū)域的局部pH值，導(dǎo)致化學(xué)性的組織刺激和細(xì)胞壞死，組織學(xué)上可常規(guī)觀察到材料引起的牙髓炎癥表現(xiàn)。壞死細(xì)胞釋放低水平的細(xì)胞因子和其他損傷信號，從而促進(jìn)壞死或?qū)⑺赖募?xì)胞的清除，導(dǎo)致一個“無菌”炎癥反應(yīng)，且可以激活隨后的牙髓治愈過程。除此之外，氫氧化鈣和MTA有抗菌作用，該作用也有助于控制感染，而且牙本質(zhì)基質(zhì)里的生物活性成分的釋放，也有助于組織修復(fù)［45］。

為了理解治療的預(yù)后，了解感染和炎癥之間的平衡是很必要的，還有對促炎和抗炎因子的理解也很必要，包括它們是如何與機(jī)體固有和獲得性免疫系統(tǒng)相聯(lián)系起來。而對于牙髓組織再生來說，發(fā)展抗炎和免疫調(diào)節(jié)的方法也是可行的，譬如基于分子生物學(xué)和表觀遺傳調(diào)控的技術(shù)，其也可以為未來的牙髓治療做出貢獻(xiàn)。

4  臨床試驗進(jìn)展

2012年10月開始的密西根大學(xué)發(fā)起的隨機(jī)對照臨床試驗，擬評價不同根管消毒方式對牙髓血運(yùn)重建成功率的影響，屬臨床Ⅱ期試驗，預(yù)期2017年4月完成，預(yù)期兩種方式結(jié)果一致（https://clinicaltrials.gov/show/NCT01827098）。Kenneth Hargreaves發(fā)起的I期臨床試驗擬評價兩種牙髓再生性方法治療牙髓壞死的年輕恒牙的有效性（REGENDO和REVASC），與傳統(tǒng)的MTA根尖誘導(dǎo)成形術(shù)的比較，該試驗由馬里蘭大學(xué)、洛瑪連達(dá)大學(xué)、北卡大學(xué)、AAE合作開展，擬招募120例，觀察2年，預(yù)計2019年12月完成，目前仍處于招募階段，其納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)較完善（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01976065）。Misako Nakashima宣稱，牙髓再生臨床試驗已經(jīng)獲日本衛(wèi)生、勞動和福利部批準(zhǔn)啟動，現(xiàn)在處于臨床I期試驗階段，其團(tuán)隊旨在使用牙髓干細(xì)胞與G-CSF再生牙髓/牙本質(zhì)，目前預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)牙髓干細(xì)胞和G-CSF聯(lián)合應(yīng)用不僅無毒副作用，且有利于牙髓牙本質(zhì)再生，為臨床應(yīng)用的安全和有效標(biāo)準(zhǔn)奠定了基礎(chǔ)［46］。而我國有關(guān)牙髓再生的臨床試驗也在幾家口腔?？漆t(yī)院經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)啟動。臨床試驗的進(jìn)展試圖為牙髓病治療體系尋找下一個進(jìn)步方向，這將使牙體牙髓科醫(yī)生能將牙髓再生性治療作為常規(guī)牙科實(shí)踐應(yīng)用于日常診療過程中。

5  結(jié)語

組織再生和工程，是組織修復(fù)/再生計劃中最具挑戰(zhàn)的部分，組織再生必須包括以下方面：血管化，含有相似的細(xì)胞密度和ECM體系結(jié)構(gòu)，引起新的成牙本質(zhì)細(xì)胞位于牙本質(zhì)表面，產(chǎn)生新的牙本質(zhì)基質(zhì)并礦化，并受神經(jīng)支配［47］。牙髓組織位于相對獨(dú)立的空間，和人體其它組織聯(lián)系較小，或許可以成為最容易突破的地方，因此在牙齒里再生出牙髓組織的目標(biāo)成了牙科研究者和組織工程研究者的共同想法。2009年針對牙髓病醫(yī)生的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，96%的調(diào)查對象相信，對于需要拔除的牙齒，再生治療方法將成為常規(guī)的治療選擇［48］。再生治療具有巨大的潛力，是一種有效的，安全的生物模式，目前仍需要大量的研究和開發(fā)工作，以推進(jìn)再生治療的進(jìn)展。

《口腔醫(yī)學(xué)》2016年11月，36卷（11）期：961-967.

來源于口腔醫(yī)學(xué)雜志