來源：《華西口腔醫(yī)學(xué)雜志》2016年4月第34卷第2期

作者：高敬 黃文明（通訊作者）  

作者單位：重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科·口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·重慶市高校市級(jí)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401147

[摘要] 目的 研究變異鏈球菌耐酸毒力因子質(zhì)子移位膜ATP酶（F-ATPase）在不同pH環(huán)境和齲病發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)，評(píng)價(jià)F-ATPase在齲病進(jìn)展中的動(dòng)態(tài)變化。方法將變異鏈球菌菌懸液在不同pH（pH4.0~7.0）和不同葡萄糖濃度（含5%和不含葡萄糖）的BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，檢測(cè)F-ATPase基因的表達(dá)水平。將雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成致齲組和對(duì)照組，其中致齲組喂養(yǎng)致齲飼料及5%葡萄糖水，對(duì)照組喂養(yǎng)普通飼料。每2周采集菌斑樣本，檢測(cè)F-ATPase基因的表達(dá)水平。第11周時(shí)取大鼠上下頜骨標(biāo)本，對(duì)磨牙進(jìn)行齲損評(píng)定。結(jié)果 1）5%葡萄糖濃度下變異鏈球菌F-ATPase基因的表達(dá)高于不含葡萄糖（P<0.05），在pH5.0時(shí)F-ATPase基因的表達(dá)最高，pH4.0時(shí)表達(dá)最低（P<0.05）。2）成功構(gòu)建了齲病動(dòng)物模型，在齲病發(fā)生發(fā)展過程中，致齲組和對(duì)照組F-ATPase的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，致齲組表達(dá)高于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論 耐酸毒力因子F-ATPase的表達(dá)變化與齲病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]齲??；牙菌斑；質(zhì)子移位膜ATP酶；pH

耐酸性是細(xì)菌在致齲過程中最重要的毒力表現(xiàn)，細(xì)菌產(chǎn)酸后若不能耐酸， 則細(xì)菌就不能繼續(xù)生存、代謝。Bender等[1]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的耐酸性與細(xì)菌膜對(duì)質(zhì)子的透過性有關(guān)，變異鏈球菌的耐酸性主要依賴于細(xì)胞膜上的質(zhì)子移位膜ATP酶（membranebound proton-translocatingATPase，F(xiàn)-ATPase），通過F-ATPase將質(zhì)子泵出胞內(nèi)，使胞內(nèi)pH（pHi）高于胞外pH（pHo），即維持了一個(gè)跨膜梯度ΔpH（pHi-pHo），保持胞內(nèi)pH接近中性，保護(hù)胞漿中與糖酵解相關(guān)酶的活性，使菌細(xì)胞在低pH的苛刻環(huán)境中仍能產(chǎn)酸、生存并最終導(dǎo)致齲病的發(fā)生[2-3]。可見，F(xiàn)-ATPase是變異鏈球菌致齲菌耐酸的引擎和馬達(dá)，與齲病的發(fā)生密切相關(guān)。

目前尚缺乏關(guān)于變異鏈球菌耐酸毒力因子FATPase在齲病發(fā)生發(fā)展過程中的研究，為了進(jìn)一步了解F-ATPase在齲病進(jìn)展中的變化，本研究建立致齲動(dòng)物模型縱向研究F-ATPase基因在齲病進(jìn)展中的表達(dá)變化，比較F-ATPase基因在不同pH環(huán)境的表達(dá)，以評(píng)價(jià)生物膜中耐酸毒力因子F-ATPase與齲病發(fā)生的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及動(dòng)物

變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）標(biāo)準(zhǔn)株UA159由四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。18 d齡的雄性Wistar大鼠購于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)為SYXK（渝）2012-0001。

1.2 主要試劑及儀器

BHI培養(yǎng)基（OXOID公司，英國），YJ-875型超凈工作臺(tái)（蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司），F(xiàn)Q-聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（Bio-Rad公司，美國） ，200型分光光度計(jì)（Thermo Fisher公司，美國），pH計(jì)（Mettler Toledo公司，瑞士），Bio-Rad電泳儀（Bio-Rad公司，美國）。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank報(bào)道的變異鏈球菌F-ATPase β亞基基因[4]序列及16sRNA基因序列（GenBankaccession number NC_004350），采用Primer primer 5.0計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)引物。F-ATPase上游引物 5’-CGGATGCGTGTTGCTCTTACTG-3’，下游引物5’-GGCTGATAACCAACGGCTGATG-3’；16sRNA上游引物5’-TGGAACTGAGACACGGTCCA-3’，下游引物5’-CGCTTTACGCCCAGTAATTCCG-3’。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4 不同pH和葡萄糖濃度下變異鏈球菌F-ATPase基因的表達(dá)

將變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株UA159復(fù)蘇，培養(yǎng)24 h，3 000 r·min-1離心15 min， 棄上清，用無菌生理鹽水于紫外分光光度計(jì)540 nm處制備成吸光度為1.0的菌懸液備用。以0.5為間隔配制pH4.0~7.0系列的含5%葡萄糖和不含葡萄糖的BHI液體培養(yǎng)基。取變異鏈球菌懸液，按菌液與BHI液體培養(yǎng)基1∶10的體積比接種細(xì)菌 ，37 ℃厭氧培養(yǎng)至16 h指數(shù)生長(zhǎng)期，每個(gè)樣品一式3份，3 000 r·min-1離心 15 min收集菌體，通過RNAiso Plus（Takara公司，日本）提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為20 μL，含SYBR Premix Ex Taq（2x）10 μL （包括DNA Taq酶、Mg2+、dNTP、SYBR GreenⅠ熒光染料和Buffer緩沖液）、上下游引物各0.5 μL、模板cDNA 2 μL，加滅菌去離子水至20 μL。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)設(shè)置為三步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：95 ℃預(yù)變性3min，95 ℃變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。在延伸階段收集熒光信號(hào)，循環(huán)結(jié)束后附加溶解曲線分析：95 ℃ 15 s，62 ℃ 23 s，95 ℃ 15 s。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次， 取均值，收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，測(cè)定各樣品的循環(huán)閾值（Ct值），通過2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 齲病動(dòng)物模型的建立及變異鏈球菌F-ATPase基因表達(dá)檢測(cè)

    12只18 d齡的雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為2組，致齲組6只，喂養(yǎng)致齲飼料2 000號(hào)及5%葡萄糖水；對(duì)照組6只，喂養(yǎng)普通飼料。從第1周開始每2周采集菌斑樣本（共6次），采集樣本前2 h大鼠禁食，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，以棉拭子采集磨牙面及頰舌（頰腭）面的菌斑，置于含硫乙醇酸鹽傳送液的離心管中洗脫，將樣本收集于離心管中，提取混合菌斑RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（引物及反應(yīng)體系同上）。結(jié)果取均值，通過2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

第11周時(shí)處死大鼠，取上下頜骨標(biāo)本，染色，根據(jù)Keyes經(jīng)典評(píng)分方法[5] 對(duì)磨牙進(jìn)行齲損評(píng)定，將齲損分為4級(jí)。E級(jí)：僅限于釉質(zhì)；Ds級(jí)：累及釉質(zhì)及牙本質(zhì)外層1/4以內(nèi)；Dm級(jí)：累及牙本質(zhì)厚度的1/4至3/4；Dx級(jí)：累及超過牙本質(zhì)厚度的3/4，甚至達(dá)牙本質(zhì)全層。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組之間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 變異鏈球菌F-ATPase基因及16sRNA內(nèi)參基因

F-ATPase基因和16sRNA內(nèi)參基因經(jīng)常規(guī)PCR都能得到特異性擴(kuò)增，2%凝膠電泳顯示各基因各實(shí)驗(yàn)組中的cDNA產(chǎn)物均為單一條帶（圖1、2），條帶片段大小與引物預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致。

2.2 不同pH和葡萄糖濃度下變異鏈球菌F-ATPase基因的表達(dá)

不同pH和葡萄糖濃度下變異鏈球菌F-ATPase基因的表達(dá)見圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1）在pH5.0時(shí)FATPase基因的表達(dá)最高，然后依次是pH5.5、6.0、6.5， 7.0，4.5，最低的是pH4.0（P<0.05）；2）5%葡萄糖濃度下F-ATPase的表達(dá)高于不含葡萄糖（P<0.05）。

2.3 大鼠磨牙齲病動(dòng)物模型的建立

11周后處死大鼠，取磨牙進(jìn)行Keyes評(píng)分，結(jié)果見圖4和表1。實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了齲病動(dòng)物模型，各組Wistar大鼠磨牙均有不同程度的齲損發(fā)生，但是齲損發(fā)生的嚴(yán)重程度、累及范圍不盡相同。致齲組齲齒計(jì)分明顯高于對(duì)照組，且齲壞病變的程度要高于對(duì)照組。對(duì)照組牙齒的損壞最小，僅達(dá)到牙本質(zhì)中層，致齲組齲損多數(shù)達(dá)牙本質(zhì)中層，其次是牙本質(zhì)深層。

2.4 齲病過程中F-ATPase基因的表達(dá)

齲病過程中各組F-ATPase基因的表達(dá)見表2。在齲病的發(fā)生發(fā)展過程中，隨時(shí)間的推移各組F-ATPase基因的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，致齲組表達(dá)高于對(duì)照組（P<0.05），第9周后，致齲組增長(zhǎng)程度有一定下降，對(duì)照組的表達(dá)下降。

3 討論

F-ATPase具有調(diào)節(jié)胞漿pH以及決定菌細(xì)胞耐酸性的生物學(xué)特性。細(xì)菌細(xì)胞的胞外質(zhì)子向胞內(nèi)擴(kuò)散降低胞內(nèi)pH，影響對(duì)酸敏感的糖酵解的活性，為了最大程度的發(fā)揮糖酵解的活性，致齲菌通過細(xì)胞膜和F-ATPase抵抗胞漿的酸化，F(xiàn)-ATPase將質(zhì)子泵出細(xì)胞從而調(diào)節(jié)pH，使致齲菌在低pH值環(huán)境下仍能進(jìn)行糖酵解 [6-7]。

早期齲病研究表明，環(huán)境pH和糖在齲病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用 ，而口腔原位環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜且動(dòng)態(tài)變化的環(huán)境，獲取大鼠致齲過程中牙菌斑pH較困難，為了研究高糖濃度下變異鏈球菌FATPase基因的表達(dá)與pH之間的關(guān)系 ，本研究設(shè)計(jì)了體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，變異鏈球菌在5%葡萄糖濃度下耐酸毒力因子F-ATPase表達(dá)高于不含葡萄糖環(huán)境。研究[8]表明，在高糖濃度下，變異鏈球菌的黏附毒力、產(chǎn)酸毒力、耐酸毒力及耐藥毒力均高于低糖或無糖環(huán)境下， 由此推測(cè)，高糖濃度下變異鏈球菌致齲能力上調(diào)。當(dāng)外界環(huán)境中有充足的糖源時(shí)，變異鏈球菌能迅速合成胞外多糖，伴隨著產(chǎn)酸耐酸能力的增強(qiáng)，環(huán)境中pH迅速下降，變異鏈球菌在酸壓力狀態(tài)下通過上調(diào)耐酸因子F-ATPase表達(dá)來維持生存代謝。Kuhnert等[4]對(duì)浮游狀態(tài)的變異鏈球菌F-ATPase基因表達(dá)研究證實(shí) ，在pH5.0時(shí)mRNA的表達(dá)水平大約是pH7.0時(shí)的2倍。研究[9]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中的pH由8.0下降至5.0時(shí)，變異鏈球菌的F-ATPase活性提高4倍，從而增強(qiáng)了其質(zhì)子泵作用。本實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，高糖濃度下變異鏈球菌F-ATPase基因的表達(dá)高于無糖或低糖環(huán)境，F(xiàn)-ATPase的表達(dá)在pH5.0時(shí)最高，pH4.0時(shí)最低，pH5.0到7.0時(shí)F-ATPase表達(dá)緩慢降低，在pH5.0以下時(shí)F-ATPase的表達(dá)急劇減少。學(xué)者[10]研究對(duì)比了干酪乳桿菌、變異鏈球菌和血鏈球菌3種耐酸性分別為高、中、低的口腔耐酸菌膜結(jié)合F-ATPase的pH活性范圍，發(fā)現(xiàn)其最適pH值分別為5.5、6.0和7.0，證明了細(xì)菌的相對(duì)耐酸性與F-ATPase的活性和最適pH值有關(guān)，活性越大，最適pH值越低。在酸性環(huán)境中排除胞內(nèi)多余H+能力越強(qiáng)，因而越耐酸?？梢娫谧钸mpH以內(nèi)，F(xiàn)-ATPase的表達(dá)隨pH降低而升高，而當(dāng)pH降低至5.0以下時(shí)，酶活性超過最適pH使F-ATPase的表達(dá)量下降，同時(shí)強(qiáng)酸的環(huán)境壓力可以使細(xì)菌合成ATP不足，并破壞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白結(jié)構(gòu)使之死亡[11]。通過對(duì)大腸桿菌的研究，Kasimoglu等[12]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-ATPase的表達(dá)量在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)控是多層次的，其中細(xì)菌的生長(zhǎng)率在F-ATPase的產(chǎn)生和表達(dá)中起著比較重要的作用，大量細(xì)菌死亡也會(huì)導(dǎo)致生物膜中F-ATPase的表達(dá)量大大減少。同樣在pH5.0以下的環(huán)境，隨著變異鏈球菌的大量死亡，F(xiàn)-ATPase的基因表達(dá)在高糖和無糖環(huán)境中差異較小。

齲齒Keyes評(píng)分結(jié)果顯示，致齲組齲齒計(jì)分明顯高于對(duì)照組，且齲壞病變的程度要高于對(duì)照組，證明本實(shí)驗(yàn)齲齒模型的建立成功。實(shí)驗(yàn)中所使用的致齲飼料為高糖飼料，大鼠牙菌斑長(zhǎng)期暴露在高糖的環(huán)境中，致齲菌有足夠的底物產(chǎn)酸，造成牙菌斑內(nèi)pH持續(xù)下降，在齲病發(fā)生發(fā)展過程中，致齲組和對(duì)照組F-ATPase表達(dá)均逐漸增強(qiáng)，致齲組表達(dá)高于對(duì)照組，第9周后，致齲組增長(zhǎng)程度有一定下降，對(duì)照組的表達(dá)有一定下降。在實(shí)驗(yàn)過程中第5周時(shí)大鼠齲壞開始出現(xiàn)， 在齲壞啟動(dòng)前期，變異鏈球菌等致齲菌大量產(chǎn)酸，使菌斑內(nèi)pH達(dá)到脫礦臨界值pH5.0~5.5。F-ATPase是一種應(yīng)激蛋白，當(dāng)外界環(huán)境pH下降時(shí)，變異鏈球菌F-ATPase基因表達(dá)上調(diào)，從而合成更多的F-ATPase蛋白以排除更多的氫離子維持細(xì)菌的生存，當(dāng)更多的氫離子排到外環(huán)境時(shí)，環(huán)境中的pH繼續(xù)下降酸蝕牙齒致齲。當(dāng)齲病發(fā)展到第9周時(shí)，牙菌斑內(nèi)微生物已經(jīng)形成一個(gè)穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，隨著唾液蛋白等的中和緩沖作用，牙菌斑內(nèi)pH值上升[13]，F(xiàn)-ATPase表達(dá)下調(diào)。學(xué)者[14]分離臨床牙菌斑中變異鏈球菌，結(jié)果表明高齲牙菌斑變異鏈球菌分離株黏附、產(chǎn)酸和耐酸能力高于無齲牙菌斑分離株。本實(shí)驗(yàn)中致齲組耐酸因子表達(dá)亦高于對(duì)照組。對(duì)照組大鼠使用的普通飼料內(nèi)碳水化合物含量較低，大鼠本身的口腔自潔能力較強(qiáng)，唾液分泌較多，對(duì)菌斑內(nèi)pH緩沖能力強(qiáng)，使菌斑pH維持在一個(gè)穩(wěn)定的范圍，F(xiàn)-ATPase的表達(dá)也維持在一個(gè)穩(wěn)定的范圍。

本文對(duì)變異鏈球菌耐酸毒力因子F-ATPase在不同pH中的基因表達(dá)進(jìn)行了研究，并建立了大鼠致齲模型，結(jié)果顯示，變異鏈球菌F-ATPase在pH5.0時(shí)表達(dá)最高，致齲組大鼠在齲病發(fā)展過程中F-ATPase表達(dá)上調(diào)，提示耐酸毒力因子F-ATPase在釉質(zhì)脫礦及齲病的形成中發(fā)揮著重要的作用。